图1.研究嵌合抗原受体T细胞流程。
·供体T细胞的分离；
·体外活化；
·转导；
·扩增；
·表型分析；
·功能分析。
过继性T细胞疗法（Adoptive T cell therapies）是针对癌症的免疫治疗创新的最前沿技术。其中一种非常有前景的方法，就是用表达嵌合抗原受体（CAR,Chimeric Antigen Receptor）的自体T细胞治疗癌症患者。最近，CAR-T细胞疗法在对抗恶性血液病（hematologic malignancies）方面所取得的成功，已引起了对免疫治疗领域（immunotherapeuticfield）的极大兴趣。如今遗传改造T细胞的巨大潜力甚至扩展到实体瘤（solidtumors）核传染病领域。在将这种“活体药物（livingdrug）”转移到诊所之前，CAR-T细胞必须在小规模的实验室试验中进行临床前的开发、优化和验证。为了促进你的CAR-T研究，本文提供可靠的研究CAR-T细胞工作流程，包括供体T细胞的分离以及有效激活、CAR基因结构的转导、CAR-T细胞扩增，以及最终细胞产品的表型核功能分析。例如，在病毒转导之前，T细胞的CD4和CD8被磁珠（如MicroBeads）特异性结合，再通过磁性富集从人外周血单核细胞（PBMC）中分离出来，接着用T细胞活化试剂（如T Cell TransAct™）激活。在成功转基因（gene-delivery）之后，CAR-T细胞（如特异性表达CD19抗原）在添加细胞因子（如IL-7和IL-15）的细胞培养基（如TexMACS™）中扩增。最后，通过杀伤试验（a killing assay）和细胞因子分析（cytokineanalysis）进行体外（in vitro）抗原特异性和功能验证。
实验一、定量研究CAR-T细胞介导的细胞毒性（肿瘤细胞杀伤率）
1. 第12天，用培养基清洗两次，制备无细胞因子（cytokine-free）的CAR-T细胞。具体操作是用培养基将管子充满到最大体积，300×g离心10分钟，然后彻底吸弃上清，用不含任何细胞因子的培养基重悬浮。
2. 在96孔板中接种靶细胞（如JeKo-1 GFP+ CD19表面蛋白表达靶细胞）和对照细胞（JeKo-1 GFP+ CD19敲除细胞）。
3. 无细胞因子培养24小时后，测定CAR-T细胞的数量。
4. 细胞悬浮液300×g离心10分钟，然后彻底吸弃上清。
5. 用PBS重悬浮细胞至每毫升含有2×107个细胞。
6. 按不同比例（如E:T=10:1, 5:1, 1:1, 0.2:1）在含有靶细胞（T）或对照细胞的96孔板中加入CAR-T细胞（效应细胞E）。
7. CAR-T细胞与相应的靶细胞共培养24小时。
8. 从培养箱中取出96孔板，放在2-8℃冰箱中孵育20分钟。
9. 从96孔板的每个孔吸取100μL上清液用于细胞因子分析，然后补充100μL不含补充剂的新鲜培养基。
10. 利用流式细胞仪（如MACSQuant® Analyzer）分析靶细胞的GFP荧光强度，确定杀伤率。确保在流式细胞仪的容器中含有足够的工作缓冲液（running buffer）和清洗液，并且废液瓶必须是空的。
11. 确保流式细胞仪自动加入碘化丙啶（propidium iodide）。
12. 设置样品体积（200μL）和吸取体积（100 μL），选择收集模式为“High”，并选取“Mixing”。
13. 开始收集所有的样品。
图2.CD19CAR-T细胞对GFP+ CD19+ JeKo-1靶细胞的杀伤与比例相关。从3个独立供者（A-C）的PBMC中分离CD4+和CD8+T细胞，制备CD19CAR-T细胞。第12天，用杀伤试验对CD19 CAR-T细胞进行功能测试。转导的T细胞与GFP+ CD19+ JeKo-1套细胞淋巴瘤靶细胞系或CD19敲除（k.o.）变异对照以特定的比例（如10:1, 5:1, 1:1, 0.2:1）共培养。利用流式细胞仪（如MACSQuant®Analyzer）分析靶细胞的GFP荧光强度，测定杀伤率。流式细胞术分析显示，CD19CAR-T细胞过量5倍时，对靶细胞的杀伤率约为80%。当通过减少CAR-T细胞的数量来改变共培养的比例时，至少有18%的靶细胞被杀死。相比之下，CD19 k.o, JeKo-1变异对照细胞没有被CD19CAR-T细胞杀死，突出了CAR-T细胞的特异性。
实验二、细胞因子分析：测定共培养上清液的细胞因子浓度（MACSPlexCytokine 12 人细胞因子检测试剂盒）
来自三个独立供体的CD19CAR-T细胞与相应的靶细胞（CD19+ JeKo-1和CD19k.oJeKo-1）培养20小时。收集细胞培养上清液，离心去除颗粒物。采用MACSPlexCytokine 12 人细胞因子检测试剂盒对未稀释的样品进行分析。采用了两条标准曲线，并通过流式细胞仪测定了12种细胞因子的浓度。
MACSPlex捕获微球是由12种不同细胞因子（GM-CSF, IFN-α, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9,IL-10, IL-12p70,IL-17A, 和 TNF-α）抗体的微球组成，包被不同细胞因子的微球上标记了不同的荧光强度，以便于一次性检测12种细胞因子的浓度。
在室温下进行试验。操作迅速并保持样品避光，例如在孵育阶段用铝箔覆盖板子或管子。
待测样品应该重复进行测定，例如两次或三次重复，并且进行不同比例的稀释以确保荧光值在标准曲线的动态范围内。
在同一天进行流式细胞仪采集，因为样品的长时间储存会导致背景增加和灵敏度降低。
图3.利用MACSplex细胞因子试剂盒进行共培养上清的细胞因子（GM-CSF,IFN-γ, IL-2, and TNFα）分析。（A）在靶细胞表面识别CD19受体后，CD19 CAR-T细胞分泌了促炎细胞因子。（B）CD19 CAR-T细胞与CD19敲除的靶细胞共培养，分泌了微量的细胞因子。这证实了CAR-T细胞的功能和抗原特异性。
图4.MACSPlexCytokine 12工作原理示意图。将待测样品和包被有细胞因子特异性抗体的MACSPlex（MPx）捕获微珠共同孵育，样品中的细胞因子将会和MPx微珠上的抗体特异性结合。再加入APC（别藻蓝蛋白）偶联的含有12种细胞因子抗体的cocktail检测试剂共同孵育，形成MPx捕获微球—待测样品—检测试剂的复合物。通过试剂盒中已知浓度的标准品绘制标准曲线，根据对该复合物中MPx捕获微球特异性荧光以及检测试剂荧光强度的分析，计算出待测样品中各细胞因子的浓度。
（一）制备MACSPlexCytokine 12的的标准品
·仅使用新制备的标准溶液，不要存储或重复使用。·使用聚丙烯或聚苯乙烯试剂管，不要使用玻璃瓶。·标准曲线的生成需要八个样本：标准的七个样品和一个空白对照。这些样品需复孔（duplicates）测量。
1.将细胞因子标准品（如IL-4, IL-5, IL-17A, IL-23, IL-2, IL10, IL-12p70,IFN-γ, TNF-α, GM-CSF）的冻干粉（lyophilized）拿出来解冻。
2. 根据浓度要求（pg/mL）加入相应体积（如200 μL）的缓冲液或培养基（如MACSPlex Buffer或者TexMACS™Media）溶解，轻轻混匀作为原液（stock solution）。
3. 标记六个试剂管并按以下顺序排列：
a.1:5
b.1:25
c.1:125
d.1:625
e.1:3125
f.1:15,625
4. 每个试剂管加入200 μL的相应缓冲液或培养基。
5. 在标记为1:5的试剂管中加入50μL细胞因子原液并充分混合，进行1:5稀释。从标记为1:5的试剂管吸取50μL溶液，加入到标记为1:25的试剂管中，依此类推（so on to）至标记为1:15,625的试剂管，进行1:5连续稀释（serial dilutions）。在吸取前，混匀每种稀释液。
6. 将相应的缓冲液或培养基作为空白对照（blank control, 0 pg/mL）。
（二）96孔板分析方法的建立
前两列为标准品，七个标准品均为复孔测定，标准品的排列由最低浓度（空白对照）至最高浓度（标准品原液），从新的一列开始加待测样品。
实验三、小鼠体内CAR-T细胞增殖情况多时间点检测（qPCR）。
图5.小鼠体内CAR-T细胞增殖情况多时间点检测。CAR-T注射入小鼠体内，需要检测CAR拷贝数。如果CAR拷贝数随天数增加，表明CAR-T细胞在体内具有扩增能力。
***参考资料：
Engineering of CAR T cells for research use
如果觉得《研究嵌合抗原受体T细胞的工作流程（功能验证部分）》对你有帮助，请点赞、收藏，并留下你的观点哦！
