【临床研究】冷冻胚胎复苏周期胚胎移植策略的选择

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作者：刘景 孔红娇 管一春 赵君亮 李嘉恒 张玉超 刘晓阳 李怡梦 王兴玲

作者单位：郑州大学第三附属医院生殖医学中心450052

通信作者：王兴玲，Email：wangxl208@，电话：+86-18637108281

摘要

目的初步探讨冷冻胚胎复苏周期中已冻存的低质量囊胚与高质量卵裂期胚胎的优先移植顺序。

方法回顾性分析了郑州大学第三附属医院生殖医学中心11月至5月期间3677个冻融胚胎移植(FET)周期的临床资料。根据移植胚胎发育时期、质量及移植胚胎数的不同分为5组：单非优质囊胚组(A组)、单优质囊胚组(B组)、第3日(D3)双优质胚胎组(C组)、D3优+非优质胚胎组(D组)、D3双非优质胚胎组(E组)。每组再根据患者的年龄分为3个亚组：<35岁、35~37岁和>37岁。主要观察指标为活产率，次要观察指标为临床妊娠率、植入率和多胎率。

结果D3双胚胎移植组(C~E组)植入率均显着低于单囊胚组(A、B组)(P均<0.05)，而多胎妊娠率均显着高于单囊胚组(P均<0.01)。C组与A组相比，临床妊娠率差异无统计学意义(P>0.05)；患者年龄<35岁时，活产率显着升高(P=0.003)，35~37岁组及>37岁组活产率的差异无统计学意义。D组与A组相比，患者年龄<35岁组及35~37岁组，临床妊娠率及活产率差异均无统计学意义(P>0.05); 患者年龄>37岁时，临床妊娠率显着降低(P=0.018)，活产率降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。E组与A组相比，所有年龄段的临床妊娠率、活产率均降低；当患者年龄<35岁及>37岁时差异均有统计学意义(P<0.05)，患者年龄为35~37岁时，差异无统计学意义(P>0.05)。年龄和移植胚胎的种类均是活产的独立影响因素。调整年龄对活产的影响后，与A组相比，B组(OR=1.311，95% CI=1.083~1.586，P=0.005)、C组(OR=1.322，95% CI=1.092~1.601，P=0.004)、E组(OR=0.616，95% CI=0.468~0.809，P=0.001)对活产率的影响差异均有统计学意义，而D组(OR=1.139，95% CI=0.914~1.420，P=0.247)对活产的影响程度与A组相比，差异无统计学意义。

结论综合考虑多胎妊娠及活产等因素，冷冻胚胎复苏周期最优的移植顺序可能是单优质囊胚>单非优质囊胚>D3双优质胚胎>D3优+非优质胚胎>D3双非优质胚胎。

【关键词】冻融胚胎移植；移植策略；活产；临床妊娠

基金项目：河南省医学科技攻关计划项目(02133)

DOI：10.3760/101441-0508-00185

辅助生殖技术发展40多年，给无数个不孕家庭带来了福音。技术的关注点已经从最初的追求高临床妊娠率到目前的保障母体孕期的安全和子代安全性方面[1]。囊胚移植的高妊娠率及低多胎率的目标使得各大中心大力开展囊胚培养。但囊胚培养潜在的取消周期风险使得患者较难接受全囊胚培养[2]。较多中心据此调整后的策略是对卵裂期胚胎部分冷冻，部分行囊胚培养，形成可利用囊胚后再进行冷冻[3]。在随后的冷冻胚胎复苏周期中，对于已经冻存的低评分囊胚与高评分卵裂期胚胎，到底优选哪种进行移植更合理，目前并无定论。国外由于全囊胚的普及，很少会遇到此现象，尚未见到相关的文献报道。而国内此方面的文献多集中在不同发育时期胚胎移植后结局的比较，并未对比不同时期不同胚胎级别对妊娠结局的影响。同时，国内文献报道的妊娠结局也局限于临床妊娠率，对活产率的影响也少有报道。因此，本文回顾性分析冻融胚胎移植(FET)周期的相关数据，比较不同级别的卵裂期胚胎和囊胚的移植结局，期望能为临床移植方案的制定提供数据支持。

资料与方法

一、研究对象

使用郑州大学第三附属医院生殖医学中心辅助生殖电子病历系统数据库，回顾性分析11月至5月期间于本中心实施FET的患者资料。根据移植胚胎发育时期、质量及移植胚胎数的不同分为5组，单非优质囊胚组(A组)、单优质囊胚组(B组)、D3双优质胚胎组(C组)、D3优+非优质胚胎组(D组)、D3双非优质胚胎组(E组)。根据患者的年龄分为3个亚组：<35岁、35~37岁、>37岁。纳入标准：①前周期的受精方式是体外受精(IVF)或卵胞质内单精子注射(ICSI)；②第1~2次移植周期；③单囊胚移植或双卵裂期胚胎移植。排除标准：反复移植失败、受卵FET、植入前遗传学检测(PGT)-FET、内分泌疾病、宫腔病变、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、输卵管积液。本研究符合《赫尔辛基宣言》。

二、研究方法

1. 临床促排卵及复苏周期内膜准备方案:超促排卵采用本中心常规长方案、短方案，于人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射后36~38 h取卵，hCG注射后39~42 h进行IVF/ICSI授精。FET周期内膜准备方案采用本中心常规方案，分为自然周期、人工周期、刺激周期[4]。

2. 胚胎培养及评分:授精、受精及卵裂观察、卵裂期胚胎评分采用中心常规做法，参考文献[5]。卵裂期胚胎评分：Ⅰ级为细胞大小相对均匀，形态规则，胞质清晰，无颗粒及多核现象，碎片<5%；Ⅱ级为细胞大小稍不均匀，形态稍不规则，碎片为6%~20%；Ⅲ级为细胞大小明显不均匀，存在明显的形态不规则，碎片为21%~50%；IV级为细胞大小严重不均匀，胞质可有严重的颗粒现象，多核，碎片>50%。Ⅰ级、Ⅱ级为优质胚胎；Ⅲ级为可利用非优质胚胎。第2日(D2) 细胞数为2~4、第3日(D3)细胞数为6~10的胚胎可评为优质胚胎，余均降级为III级及以下。囊胚评分参照Garder评分方法[6]，滋养外胚层细胞及内细胞团均不为C时评为优质囊胚，两者中任一评为C则为非优质囊胚，两者均为C评为不可利用囊胚。

3. 胚胎冷冻及复苏:采用日本Kitazato 公司的冷冻复苏试剂及载体。室温下将胚胎移至平衡液中平衡10 min，然后转移至玻璃化冷冻液中平衡，并迅速把胚胎放到载体上，并迅速浸入液氮。胚胎在冷冻液中的时间控制在1 min之内。在37 ℃下，从液氮中取出载体，将胚胎立即浸入37 ℃的解冻液中1 min；再转移到稀释液中3 min，再转移到洗液1中3 min，再转移至洗液2中3 min，最后移入G-1液（瑞典Vitrolife 公司）中培养等待移植。复苏过程，解冻液中操作在37 ℃，余均室温条件下进行。

4. 胚胎移植及随访:移植后予以黄体支持，移植后14 d抽血测hCG，若血hCG阳性(hCG>50 IU/L)于29 d后行B超检测，以宫腔内可见孕囊及胎心搏动定义为临床妊娠。

5. 临床指标的计算方法:临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；胚胎植入率=超声见孕囊数/移植胚胎数×100%；多双胎妊娠率=2个及以上胎心周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率=活产周期数/移植周期数×100%。

三、统计学方法

数据采用SPSS17.0进行统计学处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示，组间比较采用方差分析。计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验。活产相关因素的分析采用二变量逻辑回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、各组患者基本临床特征的比较

共收集到3677个FET周期的患者资料，其中A组1015例、B组824例、C组878例、D组579例、E组381例。各组间年龄、体质量指数、基础卵泡刺激素(FSH)差异均有统计学意义，各组间的子宫内膜厚度差异均无统计学意义（表1）。

二、各组移植结局的比较

C~E组植入率均显着低于A、B组(P<0.05)，而多胎妊娠率均显着高于A、B组(P<0.01)。C组与A组相比，总临床妊娠率及所有年龄段的临床妊娠率的差异均无统计学意义(P>0.05)；患者年龄<35岁时，活产率显着性升高（P=0.003），35~37岁亚组及>37岁亚组活产率的差异无统计学意义。D组与A组相比，患者年龄<35岁亚组及35~37岁亚组，临床妊娠率及活产率差异均无统计学意义(P>0.05)；患者年龄>37岁亚组的临床妊娠率显着降低(P=0.018)；活产率降低，但差异无统计学意义（P=0.259）。E组与A组相比，所有年龄段的临床妊娠率、活产率均降低；当患者年龄<35岁及>37岁时差异均有统计学意义（P<0.05），患者年龄为35~37岁时，差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

由表3可以看出，根据活产相关的逻辑回归分析显示，年龄和移植胚胎的种类均是活产的独立影响因素。年龄与活产呈负相关。在调整了年龄的影响后，移植胚胎来源对活产率仍有显着影响。与A组相比，B组(OR=1.311；95% CI=1.083~1.586)、C组(OR=1.322；95% CI=1.092~1.601)、E组(OR=0.616；95% CI=0.468~0.809)对活产率均有显着影响(P<0.05)，而D组(OR=1.139；95% CI=0.914~1.420)对活产的影响与A组相比，差异无统计学意义。

讨论

在IVF-ET技术开展的早期，由于临床促排卵技术及实验室培养条件的低下，往往会在卵裂期时期进行胚胎的移植。而为达到较好的临床结局，每周期移植的胚胎数较多，造成了较高的多胎妊娠率。随着体外胚胎培养体系的不断发展及升级，囊胚培养所要求的高质量的培养环境被达到，越来越多的中心开展了囊胚培养技术。通过囊胚培养可以对卵裂期胚胎进行再次筛选。同时，在囊胚阶段进行移植更符合自然状态下的胚胎在体内的发育规律。国外，全囊胚培养已经常态化。反观国内，大部分生殖中心虽具有培养囊胚的条件，但往往因部分胚胎可能不适合体外长时间培养而存在取消周期的风险，因此，不能大力开展全囊胚培养。目前，较多中心的做法是针对每个患者个体，在保证有1~2次卵裂期胚胎移植的机会上，对剩余胚胎再行囊胚培养。此方案的直接后果是，大部分周期会出现卵裂期胚胎与囊胚并存的现象。在随后的FET周期中，鉴于优质囊胚的高活产率、低双胎妊娠率，会被优先选择用于移植[7]。但至于已经冻存的低评分囊胚与高评分卵裂期胚胎该怎么优选进行移植，需要我们通过数据进行分析，为临床移植方案的制定提供指导。

从本中心数据来看，对于各个年龄段来说，移植单囊胚的植入率均显着高于移植卵裂期胚胎，与已发表文献结果一致[3]。本文数据表明，对于>37岁移植2枚III级胚胎的患者来说，植入率仅为8.6%，而活产率仅为8.2%。本研究所纳入的均为FET周期的数据，因此，除外胚胎质量本身的原因，非优质胚胎对冷冻解冻过程耐受力更差，冷冻复苏对胚胎的影响也是导致临床移植结局差的原因之一。因此，考虑到无效移植带来的资源浪费、对患者身心严重的打击，对于年龄>37岁、仅拥有非优质胚胎、不适合进行新鲜周期移植的患者，行囊胚培养进一步了解胚胎内在发育潜能再进行冷冻，可能会是一个更优的胚胎利用方案。而对于年龄>37岁、拥有至少1枚优质卵裂期胚胎的患者来说，囊胚培养可能导致周期的取消的风险较高[2]。同时，文中数据提示此人群的多胎发生率显着低于≤37岁人群。因此，可以尝试进行卵裂期胚胎的移植。

本文数据提示，对于≤37岁的患者，移植单个非优质囊胚的临床妊娠率与2枚优质卵裂期胚胎相比差异无统计学意义，但是其植入率远高于后者。此结果与Glujovsky等[8]所报道结果一致，但其文献中报道囊胚的活产率也显着高于卵裂期胚胎。而本研究结果提示活产率仅在<35岁亚组低于移植2枚优质卵裂期胚胎组，余与文献报道一致。原因可能是本研究中囊胚移植组所移植的囊胚是在新鲜周期冷冻或移植2枚最形态最优质的D3胚胎之后再培养获得的，仅从D3的形态学评分上是小于或等于移植D3双优质胚胎组的。而文献中移植囊胚组的囊胚来源于全囊胚培养组。然而，本文数据提示<35岁患者移植2枚优质卵裂期胚胎时多胎妊娠率高达42.8%，35~37岁高达35.2%。多胎妊娠可能带来流产、早产、低出生体质量儿等母婴风险及并发症[9-10]。在平衡了临床妊娠率和多胎妊娠率两个指标后，对于≤37岁的患者，进行囊胚培养后再移植可能会是一个较好的移植策略，既可以保证较高的临床妊娠率及活产率，又显着性地降低了多胎妊娠的发生，更能保证孕期的母婴安全及产后的子代安全性。

本研究活产相关的逻辑回归分析结果显示，年龄和移植胚胎的种类均是活产的独立影响因素，与Dobson等[11]所报道的结果一致。年龄与活产呈负相关。在调整了年龄对活产的影响后，移植单个优质囊胚和D3双优质胚胎结局是活产的可能性是移植单个非优质囊胚的1.3倍。而移植单个非优质囊胚与D3优+非优质胚胎胎结局是活产的可能性相当，均高于移植D3双非优质胚胎。移植非优质单囊胚与优质单囊胚相比，具有较低的活产率，这与已经发表的文献结果相吻合[12]。原因可能是非优质囊胚与优质囊胚相比植入率低，同时由于染色体异常比例高而导致的流产率高，最终导致了非优质囊胚的活产率低于优质囊胚。移植非优质囊胚组与不同质量的卵裂期胚胎组相比，具有不同的活产率。其活产率低于移植2枚优质D3胚胎，高于移植2枚非优质D3胚胎，与移植优质D3+非优质D3胚胎结局相当。已发表文献中较少有关此内容的研究。招霞等[13]研究结果与本文观点一致，但是仅考察了临床妊娠率及种植率，并无活产率方面的报道。笔者推测原因可能与前文所提到的本中心的移植策略相关。本中心的囊胚培养是在新鲜周期冷冻或移植2枚最形态最优质的D3胚胎之后再培养获得的。因此，所移植的单非优质囊胚其D3的形态学评分上是小于或等于移植D3双优质胚胎组的。故而，移植单非优质囊胚的活产率会低于移植双优质D3胚胎。而复苏周期进行双非优质D3胚胎移植的患者往往是新鲜周期并无优质D3胚胎可冷冻才选择冷冻非优质的卵裂期胚胎，同时，剩余胚胎并未培养出囊胚，才移植了D3非优质胚胎。因此，此类患者活产率大概率上是低于移植1枚单非优质囊胚组的患者的。因此，在不考虑多胎，而仅仅将活产作为最终的观察指标时，不同来源的胚胎的优选顺序应该是，单优质囊胚/D3双优质胚胎>单非优质囊胚/D3优+非优质胚胎>D3双非优质胚胎。但多胎妊娠潜在的种种严重风险及产后并发症均提示，加入了多胎危害的考量后，对于已经冻存的胚胎来说，最优的移植顺序也许是单优质囊胚>单非优质囊胚>D3双优质胚胎>D3优+非优质胚胎>D3双非优质胚胎。

在临床工作中，植入率是评价胚胎质量的关键指标，然而，患者认为先要达到临床妊娠才可能活产，因此更注重高的临床妊娠率。移植2枚优质胚胎的高妊娠率使得大部分患者会选择性地忽视掉双胎妊娠的风险，要求进行双卵裂期胚胎移植。同时，一部分患者对“双胞胎”的迷恋使其仍然坚持选择双卵裂期胚胎移植。最后，患者对辅助生殖技术结果的高期待，使其并不能接受囊胚培养潜在的取消风险，转而要求进行双卵裂期胚胎移植。总之，种种因素的影响使单囊胚移植甚至单胚胎移植这项移植策略较难推广。但鉴于单胚胎移植的各种优势，生殖中心需要投入更多的精力为患者耐心讲解单胚胎移植的优势及多胎妊娠的各种风险，从新鲜周期即做好单胚胎移植的准备，避免在复苏周期进退两难。

本文依据临床情况进行分组，组别较多，而每组的数据比较有限，因此，有些数据差异较大但并不具有统计学的意义。对于移植胚胎类型的排序，本文依据的仅是本中心的数据。鉴于各个中心患者人群、新鲜周期胚胎的冷冻方案不同，卵裂期胚胎及囊胚的评分标准不同等原因，结论可能并不适合每个中心。建议以中心自己的数据为出发点进行统计分析，总结出适合自己的优先顺序，指导临床实践。

参考文献（略）

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中华生殖与避孕杂志

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