乙型肝炎组织iNOS的表达与炎症分级的相关性研究 乙型肝炎组织iNOS的表达与炎症分级的相关性研究*
孙艳**，肖锋，钱铮，陈丽燕，朱琳，肖静文，顾春燕
（南通市第三人民医院病理科，江苏 226006）
[摘要] 目的：探讨诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）在乙型肝炎组织中的表达情况及与炎症分级的相关性。方法：收集HBsAg阳性肝穿刺及手术标本71例，按肝炎修正组织学活性指数（histology activity index,HAI）记分法分为G0、G1、G2、G3、G45组，运用免疫组织化学法检测iNOS在各组中的表达情况，并分析其与炎症分级的相关性。结果：iNOS阳性染色主要定位于肝细胞的细胞浆，部分淋巴细胞胞浆中也可见iNOS阳性染色；随着炎症程度增加，iNOS在肝细胞和淋巴细胞中的表达强度均逐渐增强，且表达强度与炎症分级呈正相关（肝细胞r=0.5148，P=0.0000；淋巴细胞r=0.3491，P=0.0016）；肝细胞中iNOS的表达与淋巴细胞iNOS的表达存在正相关关系（r=0.4762，P=0.0000）。结论：iNOS可作为乙型肝炎炎症分级的一项参考指标，可能与乙型肝炎病理生理过程密切相关。
[关键词] 乙型肝炎；诱导型一氧化氮合酶；炎症；免疫组织化学
诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是生物体内重要的催化酶，通过催化底物精氨酸生成一氧化氮（nitric oxide，NO）发挥生物学作用。研究表明，iNOS与炎症关系密切，细菌、病毒及多种炎症因子均可诱导其表达，产生内源性NO，进而发挥重要的生物学作用[1]。本研究选取我院病理科1月—12月收集的HBsAg阳性肝穿刺及手术标本71例，通过检测慢性乙型肝炎患者肝组织中iNOS的表达，分析其与肝组织炎症分级的相关性，旨在明确iNOS在慢性乙型肝炎炎症发展过程中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料HBsAg阳性肝穿刺及手术标本71例，其中男性35例，女性36例，年龄25～56岁。所有标本的临床资料完整、病理诊断明确，按肝炎修正组织学活性指数（histology activity index，HAI）记分法[2]分为5组，其中G012例，G116例，G215例，G318例，G410例。
1.2 免疫组化法所有标本经10%中性甲醛溶液固定后常规组织处理，4μm厚连续切片,分别行HE和免疫组化染色。其中免疫组化染色采用Evision二步法，参照试剂盒说明书进行。实验设立阳性对照和阴性对照。小鼠抗人单克隆iNOS抗体（工作浓度1∶400）购自艾博抗（上海）公司；二抗工作液及免疫组化试剂盒购自基因科技股份有限公司。
1.3 结果判断免疫组化染色结果以肝细胞质呈棕黄色颗粒（DAB显色）为阳性，采用双盲法，由两位病理医生进行评定。每例随机观察5个高倍视野（每高倍视野计数200个肝细胞/淋巴细胞）。综合阳性细胞染色强度和阳性细胞所占百分比进行评分。将染色强度分为4级：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性细胞所占百分比：＜5%0分，5%～25%1分，25%～50%2分，50%～75%3分，≥75%4分。两者相乘再相加后取平均值，分为4个等级：0～1分为阴性（-）；2～4分为弱阳性（+）；5～8分为中度阳性（++）；9～12分为强阳性（+++）。
1.4 统计学处理应用SPSS 13.0统计软件分析处理数据，各组之间比较采用Spearman等级相关检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 iNOS在慢性乙型肝炎组织中的表达免疫组化结果显示，iNOS蛋白的阳性染色主要见于肝细胞的胞质，呈棕褐色；部分淋巴细胞中也有表达。iNOS在不同炎症分级的慢性乙型肝炎组织中表达不同，随着肝脏炎症活动程度的加重，iNOS蛋白的表达逐渐增加（图1）。
图1 免疫组化法检测iNOS在不同炎症分级慢性乙型肝炎组织中的表达（200×）
2.2 iNOS在肝细胞和淋巴细胞中表达与炎症活动度的相关性由表1可见，肝细胞中iNOS表达强度在不同炎症级别中差异有统计学意义，且表达强度与炎症分级呈正相关（r=0.5148，P=0.0000）；淋巴细胞中iNOS表达强度在不同炎症级别中差异亦有统计学意义，表达强度与炎症分级亦呈正相关（r= 0.3491，P=0.0016）。
表1 肝细胞与淋巴细胞中iNOS表达与炎症活动度的关系
炎症分级例数肝细胞淋巴细胞-++++++-++++++
G012 10 2 0 0 12 0 0 0 G116 7 6 3 0 11 5 0 0 G215 4 3 6 2 9 4 2 0 G318 3 4 7 4 9 6 3 0 G410 0 0 4 6 1 6 3 0合计71 24 15 20 12 42 21 8 0
2.3 肝细胞iNOS表达与淋巴细胞iNOS表达的相关性由表2可见，统计学分析显示，肝细胞iNOS表达与淋巴细胞iNOS的存在正相关（r=0.4762，P= 0.0000，表2）。
表2 肝细胞iNOS表达与淋巴细胞iNOS的相关性 例
淋巴细胞肝细胞合计-++++++ -24 13 5 0 42 +0 2 14 5 21 ++0 0 1 7 8 +++0 0 0 0 0合计24 15 20 12 71
3 讨论
慢性乙型肝炎是常见的肝脏疾病，患者感染乙肝病毒后，病毒持续在体内复制，经单核-巨噬细胞吞噬、加工、递呈后激活T细胞介导的细胞免疫机制，从而引起肝脏的免疫病理损伤。
本研究结果显示，肝细胞和淋巴细胞中iNOS的表达强度与慢性乙型肝炎肝组织炎症分级之间呈正相关，随着肝脏炎症程度的加重，iNOS的表达明显增强。表明iNOS可能参与慢性乙型肝炎炎症反应的病理生理过程。
iNOS主要通过NO发挥生物学作用。研究表明，iNOS在各种炎症性疾病中均可被诱导表达，发挥炎症介质的作用。细菌脂多糖、病毒等炎症因子刺激机体后，能够诱导iNOS高表达，进而导致NO的大量产生，介导炎症的生理学进程。抑制小胶质细胞和星形胶质细胞中iNOS的表达，能够明显抑制炎症反应，发挥抗炎特性[3]。
NO在细胞内具有双刃剑的作用，高浓度NO和低浓度NO发挥不同的功能[4]。吴娟等[5]研究显示，iNOS在正常肝组织中无表达，慢性乙型肝炎患者肝组织内iNOS表达显著增高。HBV感染机体后，激活机体的免疫系统，产生IFN-7、TNF-α、IL-1等细胞因子，这些细胞因子可与HBV病毒协同诱导肝细胞激活iNOS基因并使其表达，产生大量NO，进而诱导肝细胞发生凋亡、增生。本研究显示，肝细胞iNOS表达与淋巴细胞iNOS的表达存在正相关，提示二者可能存在协同作用，最终导致NO的大量产生并发挥病理生理学作用。
总之，本研究证实了iNOS在慢性乙型肝炎中的表达与炎症分级的相关性，iNOS可以作为乙型肝炎炎症分级的一项参考指标，并且可能与乙型肝炎病理生理过程密切相关，对进一步理解慢性乙型肝炎病理机制具有一定的参考价值。
[参考文献]
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[2]郑杰，译.Rosai&Ackerman外科病理学［M］.10版.北京:北京大学医学出版社，：866-867.
[3]Brahmaehari S，Jana A，Pahan K.Sodium benzoate,ametabolite of cinnamon and a food additive,reducesmieroglial and astroglial in flammatory responses［J］.J Immunol，，183（9）：5917-5927.
[4]Hazam RK，Deka M，Kar P.Role of nitric oxide synthase genes in hepatitis E virus infection［J］.JViral Hepat，，21（9）：671-679.
[5]吴娟，王凯，韩利岩，等.慢性乙型肝炎患者肝组织内诱导型一氧化氮合酶的表达与肝组织病变的关系［J］.中华实验和临床病毒学杂志，，22（1）：57-59.
Association of iNOS expression with histological grading in type B hepatitis
SUN Yan,XIAO Feng,QIAN Zheng,CHEN Liyan,ZHU Lin,XIAO Jingwen,GU Chunyan
(Department of Pathology,the Third People’s Hospital of Nantong city,Jiangsu 226002)
[Abstract] Objective:To investigate the relationship between inducible nitric oxide synthase(iNOS)expression and the histological grading of liver inflammation in hepatitis B patients.Methods:Tissue specimens were collected from 71 hepatitis B patientswith HBs Ag-positive.The specimens were divided into group G0,G1,G2,G3,G4according HAIscoring method.Immunohistochemical staining was performed to detect the iNOS expression in all groups.Results:Immunohistochemical results show that the positive iNOS stainingmainly locate in hepatocellular cytoplasm,some lymphocyteswere also seen in the cytoplasm iNOS positive staining.With the increase of the grade of inflammation,iNOS expression in hepatocytes and lymphocytes strength increased,and the expression intensity and inflammation grading were positively correlated(hepatocytes:r=0.5148,P=0.0000,lymphocytes:r=0.3491，P=0.0016;respectively).There was positive correlation between hepatocellular iNOSexpression and T cells(r=0.4762，P=0.0000).Conclusion:Detecting the expression of iNOS is a valuable consult for the histological grading in hepatitis B liver tissues.iNOSmost probably played an important role in the pathophysiology process of hepatitis B patients.
[Key words] type B hepatitis;inducible nitric oxide synthase;inflammation;immunohistochemitry
[中图分类号] R512.6+2
[文献标志码]A
［文章编号］1006-2440（）06-0571-03
[收稿日期] -11-20
*[基金项目] 南通市前沿与关键技术创新项目（MS2087）；南通市卫计委青年科研基金资助项目（WQ034、WQ016）。
**[作者简介]孙艳，女，汉族，江苏连云港人，生于1986年6月，学士，主治医师。研究方向：肝脏病理。通信作者：顾春燕，E-mail: guchunyan143@
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