前言
胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的恶性肿瘤之一。肿瘤衍生的细胞外囊泡（EV）诱导转移前的生态位形成以促进转移。6月22日科隆大学医院内科和肿瘤外科团队在Cancers上发表了“Tumor-Derived Extracellular Vesicles Inhibit Natural Killer Cell Function in Pancreatic Cancer”，文章通过超速离心从高转移性胰腺癌细胞系和患者来源的原发癌细胞中分离出EV。通过质谱法分析EV的蛋白质含量;通过流式细胞术研究PDAC衍生的EV对天然杀伤（NK）细胞的影响;通过ELISA定量血清EVs的TGF-β1水平，发现整合素富含PDAC衍生的EV。与EV共培养后，NK细胞中NKG2D，CD107a，TNF-α和INF-γ的表达显着下调.NK细胞还表现出CD71和CD98水平降低，以及葡萄糖摄取能力受损。此外，NK细胞对胰腺癌干细胞的细胞毒性减弱。此外，PDAC衍生的EV诱导NK细胞中Smad2/3的磷酸化，PDAC患者血清EVs的TGF-β1显着增加。研究结果强调了PDAC衍生的EV的免疫抑制作用，并对PDAC中转移前生态位形成的NK细胞功能障碍的理解提供了新的见解。
研究思路
Figure 1：胰腺癌细胞衍生的细胞外囊泡（EV）的表征。 （a）通过透射电子显微镜（TEM）得到的胰腺癌来源的EV的代表性图像。 （b）通过纳米颗粒分析（NTA）测定胰腺癌衍生的EV的大小。 （c）通过蛋白质印迹法测定L3.6pl衍生的EV和亲代细胞的外泌体标志物ALIX，flotillin-1，TSG101，CD9，CD63，CD81和Rab5的表达。 （d）通过流式细胞术分析在与羧酸盐珠偶联的L3.6pl衍生的EV上的CD63表达。
Figure 2：胰腺癌衍生的EV的蛋白质组学分析。 （a）TBO368衍生的EV和L3.6pl衍生的EV中的蛋白质的细胞组分。 （b）胰腺癌衍生的EV中鉴定的蛋白质的分子功能。 （c）胰腺癌衍生的EV中鉴定的蛋白质的生物学过程。
Figure 3：胰腺癌衍生的EV携带粘附分子。 （a）L3.6pl衍生的EV和TBO368衍生的EV中的粘附分子的图。 （b）整合在L3.6pl衍生的EV和TBO368衍生的EV中。 （c）L3.6pl衍生的EV中ITGAV的Western印迹分析。 （d）通过共聚焦显微镜分析用PKH67标记的L3.6pl衍生的EV注射的肝脏。
Figure 4：胰腺癌衍生的EV损害天然杀伤（NK）细胞功能。 （a）来自GSE28735数据集的胰腺癌中肿瘤组织（T）和非肿瘤组织（N）中代表性免疫调节因子的相对mRNA表达.（b）nectin-2，PVR和表达通过蛋白质印迹在L3.6pl衍生的EV和L3.6pl细胞中测定TGF-β1。 （c）使用共聚焦显微镜分析由NK细胞摄取的胰腺癌来源的EV。 （d）用PBS或L3.6pl衍生的EV处理NK细胞。通过流式细胞术分析NKG2D阳性NK细胞的百分比。 （e）用PBS或L3.6pl衍生的EV预处理的NK细胞与L3.6pl细胞以1：1的比例共培养。通过流式细胞术分析NK细胞中CD107a（左），IFN-γ（中）和TNF-α（右）的平均荧光强度（MFI）。 （f）用PBS或L3.6pl衍生的EV处理NK细胞。然后通过流式细胞术分析NK细胞以确定CD71（左）和CD98（中）和2-NBDG掺入（右）的MFI。
Figure 5：胰腺癌衍生的EV抑制NK细胞对癌症干细胞（CSC）的细胞毒性。 （a）使用qRT-PCR在贴壁细胞和球体中基因表达NKG2D配体。 （b）通过流式细胞术测定贴壁细胞和球体中MICA/MICB的MFI。 （c）没有NK细胞杀伤的肿瘤球的代表性图像（左），未处理的NK细胞杀伤后的肿瘤球（中）和L3.6pl衍生的EV预处理的NK细胞杀伤后的肿瘤球（右）。 （d）没有NK细胞杀伤的肿瘤球的数量，未处理的NK细胞杀伤后的肿瘤球，以及L3.6pl衍生的EV预处理的NK细胞杀伤后的肿瘤球。
Figure 6：胰腺癌衍生的EV通过TGFβ-Smad2/3信号通路抑制NK细胞功能，并且胰腺癌患者的血清EVs TGF-β1增加。 （a）在存在或不存在SB-431542的情况下与TGF-β1或L3.6pl衍生的EV共培养后，通过流式细胞术测量NK细胞中SMAD2/3的磷酸化水平。 （b）免疫组织化学（IHC）结果显示PDAC的肿瘤组织中TGF-β1过表达。 （c）健康对照和PDAC组中每克血清EV的TGF-β1的量。
讨论
胰腺导管腺癌是最致命的恶性肿瘤之一。转移在PDAC中占癌症相关死亡的大多数。最近，已经提出转移前的生态位来阐明许多癌症实体中器官特异性转移过程的机制，例如黑素瘤，肺癌和胰腺癌。在过去的几十年中，EV在癌症的早期检测，诊断和治疗中引起了广泛的关注。此外，作为细胞间通讯的介质，发现从肿瘤细胞释放的EV与远处器官部位的细胞相互作用，最终诱导转移前的生态位用于未来的转移。尽管取得了巨大进展，但尚未确定涉及PDAC转移前生态位形成的潜在细胞和分子事件。
细胞与细胞外基质（ECM）的粘附决定了转移部位的定植，并促进了新环境中循环肿瘤细胞的存活。整合素可以与ECM中的纤连蛋白，玻连蛋白，层粘连蛋白和胶原蛋白结合，从而增强肿瘤细胞的运动性和侵袭能力。研究结果表明，整合素αv和整合素β5在胰腺癌衍生的EV中是丰富的。在静脉内注射后，PKH67标记的胰腺癌衍生的EV到达NSG小鼠的肝脏。因此，提出肿瘤来源的EV倾向于进入肝脏，将货物运送到受体细胞，并诱导转移前的生态位用于PDAC中的未来转移。
转移前生态位的一个关键特征是免疫抑制。在研究中，GO分析显示胰腺癌衍生的EV中鉴定的蛋白质参与生物调节和免疫系统过程。通过蛋白质印迹，发现胰腺癌来源的EVs显示出多种免疫调节分子。因此，推测胰腺癌衍生的EV可能参与免疫细胞功能的调节。接下来，尝试研究胰腺癌来源的EV对NK细胞的影响。首先，发现可以通过NK细胞掺入胰腺癌来源的EV。然而，仍然不确定胰腺癌来源的EV是否能够在与NK细胞共孵育时介导免疫抑制。
最近，免疫细胞的细胞代谢的重要性已经引起越来越多的关注。足够的营养和能量对NK效应功能至关重要。发现NK细胞表现出较少的CD71和CD98，以及用EV处理后葡萄糖摄取能力降低。由胰腺癌衍生的EV引起的失调的代谢影响NK细胞中的多个生物过程。结果与先前研究肿瘤衍生的EV对免疫细胞的影响的研究一致。研究结果表明，胰腺癌衍生的EV诱导NK细胞功能失调的表型，最终有助于转移前生态位的免疫抑制微环境。
没有特定症状，在早期阶段检测PDAC是一项重大挑战。EVs有望被开发为液体活检工具，用于PDAC的早期检测和诊断。最近，据报道，血浆中的外泌体PD-L1水平而非可溶性PD-L1与头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者的疾病进展相关。在研究中测量了PDAC患者血清EVs的TGF-β1水平。有趣的是，与健康供体相比，PDAC组血清EVs的TGF-β1显着升高。因此，血清EVs的TGF-β1有望用作检测PDAC的诊断工具。
除TGF-β1外，胰腺癌衍生的EV还含有多种其他免疫调节因子。PVR和nectin-2均可与NK细胞上的抑制性受体结合，包括CD96，PVRIG和TIGIT。因此，除TGF-β1外，胰腺癌衍生的EV中的PVR和nectin-2也可损害NK细胞功能。已经证明PVR/nectin-2-TIGIT轴参与减弱的NK细胞细胞毒性。作为检查点，TIGIT的受体阻断阻止了NK细胞功能障碍，并在携带肿瘤的小鼠模型中引发了NK细胞抗肿瘤反应.针对CTLA-4，PD-1和PD-L1的免疫检查点抑制剂已经显示出对非小细胞肺癌（NSCLC），晚期黑色素瘤和其他几种癌症患者的临床益处。然而，这些抑制剂在PDAC患者中效果较差。结果表明TIGIT为PDAC提供了潜在的免疫治疗靶点。
然而，本研究的局限性是尚未研究人胰腺癌衍生的EV对NK细胞的体内作用。为解决这一问题，人源化患者来源的异种移植小鼠模型可以更好地概括肿瘤异质性并模拟免疫系统的复杂性，为进一步研究提供了更好的平台。
总之，文章提出了一种新的PDAC免疫逃逸机制。胰腺癌可通过肿瘤衍生的EV在肝脏中建立转移前的生态位。携带免疫抑制性货物的胰腺癌衍生的EV介导NK细胞功能障碍。转移性胰腺癌细胞逃避NK细胞的免疫监视并最终在肝脏中产生转移。此外，血清EVs的TGF-β1可能代表了一种有前景的PDAC非侵入性诊断工具。
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EVs-Exosomes由苏大，浙大, 法国居里研究所数位博士、博后及教授创建。
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