本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种原代调节性t细胞体外扩增体系及扩增方法。
背景技术：
cd4+cd25+调节性t细胞(regulatorytcells,tregs)是体内存在的最主要免疫抑制细胞，能有效抑制免疫反应、调节免疫平衡，其在移植耐受诱导、自身免疫疾病治疗等领域的研究和应用被广泛关注。
1995年sakaguchi等研究发现小鼠缺失cd4+cd25+调节性t细胞会引发多种自身免疫性疾病，而将这些调节性t细胞回输则可抑制疾病的发生。调节性t细胞亚群在胸腺或由外周cd4+初始t细胞发育分化而来，可通过细胞间直接接触、分泌免疫抑制性细胞因子、竞争生长因子il-2等方式抑制效应t细胞增殖和分化，发挥免疫调节功能。转录因子foxp3作为调节性t细胞最重要的标志蛋白，其表达稳定与否深刻影响调节性t细胞的表型和功能。
近年研究发现，过继回输体内来源的天然调节性t细胞能有效诱导免疫耐受，成为抑制移植排斥、治疗自身免疫病的理想手段。但其在体内仅占外周cd4+的5-10％，通过分选获得的原代调节性t细胞数量少，难以满足过继回输诱导耐受的治疗需求。因此，建立稳定的原代调节性t细胞体外扩增方案是实现其临床应用的前提。
但是，目前原代调节性t细胞的体外培养仍存在以下问题：①调节性t细胞在体外表现出免疫无能，用常规培养基培养难以扩增，需加入活化因子抗cd3、cd28抗体(anti-cd3/28ab)及白介素-2(il-2)刺激细胞增殖；②采用免疫磁珠分选法能获得较高纯度的原代调节性t细胞，但仍有少量效应t细胞残留，其活化后分泌的炎性因子会导致调节性t细胞的转录因子foxp3表达下调，显著降低扩增体系中调节性t细胞纯度；③已有研究表明雷帕霉素(rapamycin,rapa)作为临床常用免疫抑制剂，可选择性抑制效应t细胞增殖，利于调节性t细胞体外扩增和foxp3稳定表达，但实际效果有限。
在此背景下，本发明提供一种原代调节性t细胞体外扩增体系及扩增方法，通过优化调节性t细胞的体外培养方案，缓解原代调节性t细胞在体外活化培养时转录因子foxp3丢失现象，维持扩增细胞的稳定性，为开发高效稳定的原代调节性t细胞体外扩增体系并实现其临床转化提供参考和依据。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种原代调节性t细胞体外扩增体系及扩增方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种原代调节性t细胞的体外扩增体系，所述扩增体系是在基础培养基中加入抗cd3/28抗体、白细胞介素-2、rapa和转化生长因子-β1(tgf-β1)配制而成，其中，抗cd3/28抗体终浓度为2μg/ml、白细胞介素-2终浓度为1000u/ml、rapa终浓度为100-200ng/ml、转化生长因子-β1终浓度为4-8ng/ml。
所述基础培养基由1640培养基中添加胎牛血清、青霉素、链霉素、丙酮酸钠、非必需氨基酸和β-巯基乙醇配制而成，在所述基础培养基中，胎牛血清体积浓度为10％、青霉素浓度为100u/ml、链霉素浓度为100μg/ml、丙酮酸钠摩尔浓度为1mm、非必需氨基酸摩尔浓度为0.1mm、β-巯基乙醇摩尔浓度为50μm。
优选的，所述原代调节性t细胞的体外扩增体系中rapa的浓度为100-150ng/ml，最优选的是100ng/ml。
优选的，所述原代调节性t细胞的体外扩增体系中tgf-β1的浓度为4-6ng/ml，最优选的是4ng/ml或5ng/ml。
优选的，所述白细胞介素-2选自人白细胞介素-2或鼠白细胞介素-2。
在本发明的优选实施方式中，所述白细胞介素-2为鼠白细胞介素-2。
本发明所述的调节性t细胞选自人调节性t细胞或鼠调节性t细胞。
优选的，所述原代调节性t细胞选自人外周血分离得到的调节性t细胞或小鼠脾脏分离得到的调节性t细胞。
在本发明的优选实施方式中，所述原代调节性t细胞为小鼠脾脏分离得到的调节性t细胞。
第二方面，本发明提供一种原代调节性t细胞的体外扩增方法，所述方法包括如下步骤：
(1)制备小鼠脾脏cd4+cd25+调节性t细胞；
(2)将上述原代调节性t细胞悬于本发明所述的扩增体系中，按1×105/孔接种于u型底96孔板，静置培养，每2天半换一次液；
(3)第5天收集细胞，对细胞进行固定破膜后，染foxp3抗体，检测foxp3蛋白表达情况。
优选的，所述步骤(1)中制备小鼠脾脏单个核细胞并采用免疫磁珠两步法分选获得原代调节性t细胞。
优选的，所述步骤(2)中细胞在37℃、5％co2恒温箱中培养。
优选的，所述步骤(3)中使用fix&
①固定细胞：将固定液和固定稀释液以1:3混匀制备固定工作液，收集细胞于1.5mlep管中，600g离心5分钟，弃上清，加入400μl固定工作液重悬，避光置于4℃孵育1小时；
②破膜和抗体孵育：用双蒸水稀释10×破膜储存液至1×破膜工作液；上一步细胞悬液800g离心5分钟，弃上清后用1ml破膜工作液洗涤，800g离心5分钟去上清，用100μl破膜工作液+3.5μlalexafluor647anti-mouse/rat/humanfoxp3抗体重悬各组细胞，避光置于4℃过夜孵育；
③foxp3蛋白检测：加入1mlpbs洗涤并离心收集染色后的细胞，重悬于pbs中并用流式仪和共聚焦显微镜检测观察细胞foxp3表达情况及foxp3+tregs占比。
如非专利文献“lossoffoxp3expressioninnaturalhumancd4+cd25+regulatorytcellsuponrepetitiveinvitrostimulation”中所述，原代调节性t细胞(ntregs)在体外扩增时会导致其标志性蛋白foxp3表达发生丢失，出现foxp3表达下调。rapa是一种新型的，无神经毒性、低肾毒性的强效免疫抑制剂，最初从链霉素菌属丝状菌中分离出来的大环内酯内抗生素、具有抗淋巴细胞增殖、抗肿瘤和抗真菌作用，广泛用于移植排斥反应、冠状动脉狭窄、自身免疫性疾病、肿瘤等治疗。rapa对cd4+cd25+调节性t细胞的诱导产生、增殖和功能维持具有十分重要的作用。但是发明人发现，rapa用于原代调节性t细胞体外培养时，对原代调节性t细胞体外扩增稳定性和转录因子foxp3表达丢失现象的改善效果并不明显。
tgf-β1作为一类能影响t细胞分化方向的细胞因子，其对体内tregs的发育极其重要，并可能维持tregs体外扩增的稳定性。基于上述技术背景，发明人将一定浓度的rapa和tgf-β1联合用于原代tregs体外扩增，发现与rapa单用组相比，rapa联合tgf-β1能显著缓解tregs扩增中foxp3表达的丢失，更利于维持原代tregs体外扩增的稳定性，上调扩增体系中tregs纯度。
附图说明
图1foxp3+tregs流式细胞术检测图
图2foxp3+tregs占比统计图
图3tregs的foxp3蛋白表达共聚焦显微镜图
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中使用的缩略词如下
雷帕霉素rapa
转化生长因子-β1tgf-β1
抗cd3/28抗体anti-cd3/28ab
白细胞介素-2il-2
鼠白细胞介素-2mil-2
制备例1基础培养基的制备
在无菌操作台中，向1640培养基(100ml)中添加胎牛血清10ml、100*双抗(青霉素+链霉素)1ml、丙酮酸钠11mg、3％谷氨酰胺(用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌)1ml、β-巯基乙醇0.39mg，充分震荡摇匀，配制成基础培养基。
实施例1体外扩增体系的制备
在制备例1得到的基础培养基的基础上加入anti-cd3/28ab0.2mg(终浓度2μg/ml)、mil-2(规格100万单位/ml)0.1ml(终浓度1000u/ml)、rapa10μg(终浓度100ng/ml)、tgf-β10.4μg(终浓度4ng/ml)，充分震荡摇匀，配成调节性t细胞体外扩增体系。
实施例2体外扩增体系的制备
制备方法与原料如实施例1，区别在于rapa加入量为15μg，终浓度是150ng/ml、tgf-β1加入量为0.5μg，终浓度是5ng/ml。
实施例3体外扩增体系的制备
制备方法与原料如实施例1，区别在于rapa加入量为20μg，终浓度是200ng/ml、tgf-β1加入量为0.6μg，终浓度是6ng/ml。
实施例4体外扩增体系的制备
制备方法与原料如实施例1，rapa加入量为10μg，终浓度是100ng/ml、区别在于tgf-β1加入量为0.5μg，终浓度是5ng/ml。
对比实施例1rapa单用体外扩增体系的制备
制备方法如实施例1，区别在于体系中不含tgf-β1，相比于实施例1为rapa单用体外扩增体系。
效果例1调节性t细胞的体外扩增及foxp3蛋白检测
s1：制备小鼠脾脏单个核细胞并采用免疫磁珠两步法(miltenyi)分选获得小鼠脾脏cd4+cd25+tregs；
s2：将上述新鲜分选的原代tregs分别重悬于实施例1和对比实施例1制备的培养体系中，按1×105/孔接种于u型底96孔板，37℃、5％co2恒温箱静置培养，每2天半换液；
s3：培养第5天收集两组细胞，使用fix&
①固定细胞：按试剂说明书将固定液和固定稀释液以1:3混匀制备固定工作液，收集细胞于1.5mlep管中，600g离心5分钟，弃上清，加入400μl固定工作液重悬，避光置于4℃孵育1小时；
②破膜和抗体孵育：用双蒸水稀释10×破膜储存液至1×破膜工作液，上一步细胞悬液800g离心5分钟，弃上清后用1ml破膜工作液洗涤，800g离心5分钟去上清，用100μl破膜工作液+3.5μlalexafluor647anti-mouse/rat/humanfoxp3抗体重悬各组细胞，避光置于4℃过夜孵育；
③foxp3蛋白检测：加入1mlpbs洗涤并离心收集染色后的细胞，重悬于pbs中并用流式仪(beckman)和共聚焦显微镜(yocogawacq1)检测观察各组细胞foxp3表达情况及foxp3+tregs占比，结果如图1-3所示。
根据图1和图2可以看出，分别在rapa单用组、rapa与tgf-β1联合培养条件下活化新鲜分选的原代小鼠tregs培养第5天(d5)流式检测foxp3+tregs占比，比较两组扩增前后foxp3+tregs纯度，整体趋势是与新鲜分选的tregs相比，体外扩增后其纯度都有所下降，但是，rapa与tgf-β1联合培养组(rapa+tgf-β1)对foxp3表达的维持效果显著优于rapa单用组(rapa)。
原代tregs扩增第5天(d5)收集各组细胞，固定破膜后孵育抗foxp3抗体，观察比较rapa单用组(rapa)和rapa与tgf-β1联合培养组(rapa+tgf-β1)的foxp3阳性细胞数量。根据图3可以看出，同流式结果一致，与rapa单用组相比，rapa与tgf-β1联合培养组扩增后细胞稳定性更好，foxp3+调节性t细胞纯度更高。
效果例2调节性t细胞的体外扩增体系优化
发明人将小鼠原代tregs分别重悬于实施例1-4制备的扩增体系中，按照效果例1所示的方法进行实验，观察各组细胞foxp3表达情况及foxp3+tregs占比。结果发现，实施例1和实施例4制备的扩增体系中原代tregs增殖效果最好，扩增后高表达foxp3的细胞最多，且两组效果相当。因此，本发明所述的扩增体系中rapa优选终浓度是100ng/ml、tgf-β1优选终浓度是4ng/ml或5ng/ml。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
技术特征：
1.一种原代调节性t细胞的体外扩增体系，所述扩增体系是在基础培养基中加入抗cd3/28抗体、白细胞介素-2、rapa和转化生长因子-β1配制而成，其中，抗cd3/28抗体终浓度为2μg/ml、白细胞介素-2终浓度为1000u/ml、rapa终浓度为100-200ng/ml、转化生长因子-β1终浓度为4-8ng/ml；
所述基础培养基由1640培养基中添加胎牛血清、青霉素、链霉素、丙酮酸钠、非必需氨基酸和β-巯基乙醇配制而成，在所述基础培养基中，胎牛血清体积浓度为10％、青霉素浓度为100u/ml、链霉素浓度为100μg/ml、丙酮酸钠摩尔浓度为1mm、非必需氨基酸摩尔浓度为0.1mm、β-巯基乙醇摩尔浓度为50μm。
2.根据权利要求1所述的体外扩增体系，其特征在于，所述原代调节性t细胞的体外扩增体系中rapa的浓度为100-150ng/ml，转化生长因子-β1的浓度为4-6ng/ml。
3.根据权利要求2所述的体外扩增体系，其特征在于，所述原代调节性t细胞的体外扩增体系中rapa的浓度为100ng/ml，转化生长因子-β1的浓度为4ng/ml或5ng/ml。
4.根据权利要求1所述的体外扩增体系，其特征在于，所述白细胞介素-2选自人白细胞介素-2或鼠白细胞介素-2。
5.根据权利要求4所述的体外扩增体系，其特征在于，所述白细胞介素-2为鼠白细胞介素-2。
6.根据权利要求1所述的体外扩增体系，其特征在于，所述的调节性t细胞选自人调节性t细胞或鼠调节性t细胞。
7.根据权利要求6所述的体外扩增体系，其特征在于，所述原代调节性t细胞选自人外周血分离得到的调节性t细胞或小鼠脾脏分离得到的调节性t细胞。
8.根据权利要求7所述的体外扩增体系，其特征在于，所述原代调节性t细胞为小鼠脾脏分离得到的调节性t细胞。
9.一种利用权利要求1-8任一所述的原代调节性t细胞的体外扩增体系进行扩增的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)制备小鼠脾脏cd4+cd25+调节性t细胞；
(2)将步骤(1)制备的原代调节性t细胞悬于权利要求1-8任一所述的扩增体系中，按1×105/孔接种于u型底96孔板，静置培养，每2天换一次液；
(3)第5天收集细胞，对细胞进行固定破膜后，染foxp3抗体，检测foxp3蛋白表达情况。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中制备小鼠脾脏单个核细胞并采用免疫磁珠两步法分选获得原代调节性t细胞。
技术总结
本发明公开一种原代调节性T细胞的体外扩增体系，所述扩增体系是在基础培养基中加入抗CD3/28抗体、白细胞介素‑2、Rapa和转化生长因子‑β1配制而成，其中，抗CD3/28抗体终浓度为2μg/ml、白细胞介素‑2终浓度为1000U/ml、Rapa终浓度为100‑200ng/ml、转化生长因子‑β1终浓度为4‑8ng/ml。与Rapa单用相比，Rapa与转化生长因子‑β1联合扩增体系中细胞稳定性更好，Foxp3+调节性T细胞纯度更高。
技术研发人员：龙丹;陈雪璐;周彦妮;李幼平;李胜富
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：.12.04
技术公布日：.02.28
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