ARM：钒和铁替代固氮酶的前世今生

原文信息

原文标题: Iron-Only and Vanadium Nitrogenases: Fail-Safe Enzymes or Something More?

发表期刊：Annual Review of Microbiology

影响因子：11.00

发表时间：.08

第一作者：Caroline S. Harwood

通讯作者：Caroline S. Harwood

第一单位：Department of Microbiology, University of Washington

原文链接：

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编译：于安澜 云南大学国际河流与生态安全研究院

摘要

钼固氮酶是一种将大气中的氮气转化为氨的酶，它对生物圈氮循环和生命的可持续性具有重要意义。在古细菌和细菌中也发现了与钼（钼）固氮酶同源的钒固氮酶和铁固氮酶，它们在活性位点上以钒或铁作为过渡金属。到目前为止，只在拥有钼固氮酶的微生物中发现了替代固氮酶。它们在细菌和古菌中的分布不如钼固氮酶广泛，效率也较低。人们一直以来认为替代固氮酶是在钼含量有限的情况下使用的安全酶。最近的研究表明，钒固氮酶可能在全球生物氮循环中发挥作用，而铁固氮酶可能有助于形成自然界微生物群落相互作用的产物。

引言

全球生物氮循环是由大气氮气（N2）还原为氨（NH3）推动的，氨是一种生物可以直接利用的氮存在形式，很容易被转化为硝酸盐等其它形式的氮，是植物的首选氮源。生物固氮是由固氮酶催化的，固氮酶是一种复杂的氧敏感金属酶。N2三键的还原是一个极其难以发生的反应，是一个完全由特定细菌和古生菌所承担的生物化学过程。所有的固氮微生物都会合成一种钼固氮酶，它的活性部位有一种独特的钼铁辅因子。钼固氮酶是由铁蛋白（nifH编码）和钼铁蛋白（nifDK编码）组成的双组分酶。钼铁蛋白是一种由两个α亚基和两个β亚基组成的异四聚体（图1a）。

图1.三种形式固氮酶的示意图。

钼固氮酶催化的总反应为

N2+ 16ATP + 8e−+ 8H+→ 2NH3+ H2+ 16ADP + 16Pi

从这个公式可以看出，固氮是一个ATP密集型反应，它还需要大量的质子和以高能量电子形式存在的还原剂。氮气还原为NH3是很难实现的，因为尽管它在热力学上是有利的，但对催化来说有一个很大的必须克服的活化能障碍（图2）。由于其催化反应的复杂性，固氮酶的周转速率很低。由于这些原因，在某些情况下它需要大量合成占细胞总蛋白高达10%的固氮酶，以维持在固氮条件下的生长。

图2.氮气还原所需要克服的活化能障碍。

在20世纪80年代发现，棕色固氮菌（Azotobacter Vinelandii）可以表达不含钼的固氮酶，这导致了钒和铁固氮酶的发现有了初步描述。这些酶由VnfHDK和AnfHDK亚基组成，它们与NifHDK亚基固氮酶是同源的，但它们的活性位点有FeV或FeFe辅助因子。其它的固氮酶还包括VnfG和AnfG亚基作为附加成分（图1a）。到目前为止，替代固氮酶只在含有钼固氮酶的微生物中被发现，很可能是因为它们依赖于Nif蛋白辅助因子的生物合成和组装，而Nif蛋白也是钼固氮酶合成所必需的。与钼固氮酶相比，钒和铁固氮酶的效率较低，分布范围也较小。

根据最近的研究，替代固氮酶催化的反应如下：

铁固氮酶：N2+ 40ATP + 20e−+ 20H+→ 2NH3+ 7H2+ 40ADP + 40Pi

钒固氮酶：N2+ 24ATP + 12e−+ 12H+→ 2NH3+ 3H2+24ADP + 24Pi

这三种固氮酶都会产生氢气（H2），这是固氮的固有产物。然而，其它的固氮酶，特别是铁固氮酶，每次N2还原比钼固氮酶产生更多的H2。基于此提出了固氮酶可能被用来产生氢气作为生物燃料的建议，而且已经有大量针对这一应用的研究。

替代固氮酶在体外的相对低效引发了人们的疑问，即它们是否对全球生物固氮有贡献，以及它们在自然界中是否具有除固氮之外的其它功能。最近的数据表明，钒固氮酶在体内可以和钼固氮酶一样有效，至少在某些情况下在某些细菌中是这样的。然而，人们一直认为，当钼在环境中受到限制时，替代固氮酶在确保微生物能够获得可利用的氮方面起到了故障保护作用，这一点有直接和间接的证据。还有一些有趣的研究认为，替代固氮酶可以在防止细菌过度减少和碳转化方面发挥其它作用。在这两种可供选择的固氮酶中，钒固氮酶从生化角度得到了更广泛的研究，这为阐明钼固氮酶的作用机制提供了新见解。铁固氮酶受到的关注要少得多，但最近的研究表明，它具有独特的性质，包括产生大量甲烷（CH4）的能力，这是其它两种固氮酶所不具备的。在此，我讨论目前已知的铁和钒固氮酶的合成，以及它们在钼固氮酶的背景下的活性，钼固氮酶在编码替代固氮酶的相同微生物中工作。本文重点介绍了固氮酶的生物学作用及其在体内的调节和活性。

系统发育分布和进化

最近一项以anfD、vnfD或nifD基因为代表的古生物和细菌全基因组中三种固氮酶的分类分布调查中发现，在古生界中，只有嗜氢基因的产甲烷菌（Eurya chaeota的成员） 固氮菌。约18%的真毛细胞基因组编码钼固氮酶，37%的基因组编码钒固氮酶，约14%的基因组编码铁固氮酶。到目前为止，对古生界成员的替代固氮酶的生化或生理研究很少。完全测序的细菌基因组包括34个门，其中10个门中的一些细菌编码nifD基因，3个门中的一些细菌编码vnfD基因，5个门中的一些细菌编码anfD基因。在4342个完全测序的细菌基因组中，7.4%编码钼固氮酶基因，10%编码铁固氮酶基因，4%编码钒固氮酶基因。微生物数据库中替代固氮酶基因的数量可能受到相对于其它细菌相对较多的厚壁菌门和变形菌门基因组测序的影响。在固氮菌中，芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌和其它属都有铁固氮酶基因（61个），但这一门的成员几乎没有关于其替代固氮酶的活性和调节的研究。研究得最好的替代固氮酶来自变形菌门的成员，特别是维纳兰迪氏菌和几种紫色的非硫光养细菌。目前在蓝藻中除了发现钼固氮酶基因外，还发现了钒固氮酶基因。多变鱼腥藻（Anabaena variabilis）ATCC 29413的钒固氮酶基因已有较深入的研究，在与其关系密切的发菜属植物中也广泛存在，其中许多是苔藓植物的共生体，包括苔藓和角藻。

一些微生物编码所有三种固氮酶同工酶。例如产氢甲烷的乙酸链霉菌、好氧的γ变形菌和沼泽红假单胞菌。对16个近缘菌株的基因组调查显示，不同的菌株具有不同的替代固氮酶基因（74个）。所有菌株均编码钼固氮酶和铁固氮酶，只有13株编码钒固氮酶。在对其它4株亲缘关系较远的红假单胞菌的研究中，4株红假单胞菌都有钼固氮酶基因，其中2株也有仅含铁的固氮酶基因。这种类型的替代固氮酶基因在密切相关的细菌中的不均匀分布与横向基因转移事件是一致的。事实上，最近有报道在苔藓植物的几种蓝藻共生体中携带vnf基因。

目前为止，尚未在与豆科植物形成根瘤的共生固氮菌，以及与苜蓿、三叶草、豌豆和其它豆科植物共生的根瘤菌中发现替代固氮酶。研究表明，这些细菌不太可能缺乏钼，因为它们的寄主植物可以从深层土壤甚至矿物质中获得并浓缩这种微量元素。这将不再需要替代固氮酶来支持植物生长。另一种可能性是，仅含钒和铁的固氮酶效率低下，使植物共生体无法利用它们来支持植物的生长。

许多研究已经使用PCR和适当的引物来鉴定环境样品中的nifH序列，作为含钼固氮酶细菌存在的生物标记物。然而，NifH和VnfH蛋白关系密切，氨基酸序列同源性高达95%，因此这些研究可能在不知不觉中发现了钒固氮酶基因。为了认识到这一点，最近的一项研究使用了anfD-和vnfD-特异性引物，在佛罗里达大沼泽地的沉积物和落叶中，以及西佩维塞特沼泽（法尔茅斯,马萨诸塞州）的沉积物中确定了替代固氮酶基因。对nifD、anfD和vnfD序列多样性的分析表明，具有替代固氮酶的已知细菌类群数量增加了约20倍，主要是在属和种水平上。

已有关于钼固氮酶进化的论文，随着更多的固氮酶基因序列的出现和AS的出现，这些分析变得更加精细。推断蛋白质关系的工具已经有所改进。在一项考虑了替代固氮酶进化的研究中，对串联的NifHDK、VnfHDK和AnfHDK蛋白进行了贝叶斯和最大似然系统发育分析，得到了三种固氮酶同工酶都在统计上良好地支持了谱系同源性。有两个明显的钼固氮酶亚系被发现。一种是来自产甲烷古细菌的蛋白质，另一种是细菌和古菌的钼固氮酶的混合物。位于两个NIF亚系之间的是钒固氮酶的单系谱系，铁固氮酶是一个分支。这一分析支持这样的观点：钒固氮酶可能是由钼固氮酶进化而来的，可能是在基因复制事件之后，而铁固氮酶可能是从钒固氮酶进化而来的。

生化方面

蛋白质序列比较明显的可以看出所有三种固氮酶同功酶都有相同的基本结构，不同的固氮酶中添加了AnfG和VnfG亚基（图1a）。AnfG和VnfG亚基的功能尚不清楚，但它们是活动所必需的。NifH/VnfH/AnfH蛋白（固氮酶）约63 kDa，NifDK/VnfDK/AnfDK蛋白（固氮酶）约230 kDa。钼固氮酶还原酶是一种同源二聚体，在与两个ATP的水解相偶联的反应中，一次向钼铁固氮酶传递一个电子。电子一次一个地从NifH中的4Fe-4S团簇传递到二氮原酶还原酶（NifDK）中被称为P团簇的8Fe-7S金属团簇。电子从P团簇转移到FeMo辅助因子，即底物还原位置。在过去的38年中，钼固氮酶的多种晶体结构已经被获得，这些晶体结构揭示了金属团簇的组成和配位，以及对催化很重要的FeMo辅助因子的特征。报道了钒固氮酶的第一个结构，这项研究和其它研究表明，FeV辅助因子的基本设计和组成与钼铁7S9C-高柠檬酸辅助因子相似，但不完全相同（图1b）。已知的与NifH蛋白中4Fe-4S簇配位的氨基酸残基以及NifDK亚基中的P[8Fe-7S]簇和FEMO辅因子在相应的VnfHDK亚基中是保守的。嵌合在AnfD中的FeFe辅因子的结构尚未确定，但光谱研究表明它与FeMo辅因子在结构上是同源的。以FeFe为前驱体合成了FeMo辅因子，然后采用一个Mo原子取代其中一个Fe原子的步骤。已有研究建议用FeFe前体作为铁固氮酶中的FeFe辅因子。

与钼固氮酶和钒固氮酶的研究相比，铁固氮酶的研究相对滞后，直到最近才对该酶还原氮气的机理进行了基本表征。重要的是，这项研究表明，从棕色拟青霉中提纯的铁固氮酶甚至不含有微量的钼或钒，正如一些人在过去的理论中所说的那样。用氘（D）进行的光谱研究还表明，只有铁的固氮酶在N2和D2下翻转时生成HD，因此它具有与钼固氮酶相同的还原消除机理。在钼固氮酶中，四个电子和四个质子聚集在FeMo辅助因子上，形成一个含有两个Fe-H-Fe键氢化物的状态。这两种氢化物结合在一起，在还原消除步骤中产生氢，该步骤与N2结合和还原相耦合（图1c）。虽然还原消除机制很好地解释了为什么钼固氮酶每还原一个N2就产生一个H2，但只有铁固氮酶比钼固氮酶生成的H2多得多，大约是每还原一个N2分子产生6-7个H2。这很可能反映了铁固氮酶生成N2的Km值比钼固氮酶要高出5倍，因此在一个大气压下，N2不足以超过通常在没有N2的情况下被固氮酶催化的氢化物质子化反应，从而产生H2。类似的证据解释了为什么钒固氮酶比铁固氮酶产生的H2量少，但比Mo酶多。

图3.Rhodopseudomonas palustris中nif、vnf和anf三种固氮酶基因的组织结构。

活性钒和铁固氮酶的合成与组装

钼固氮酶的最小特定基因集，包括其结构基因、FeMo辅因子合成基因和酶组装基因，被认为是nifH、nifD、nifK、nifB、nifE和nifN（图3）。此外，nifU和nifS基因产物对于供应Fe-S簇很重要，nifV基因通常存在于一些微生物和编码一种蛋白质，催化合成FeMo辅因子的核心成分同柠檬酸。然而，根据物种的不同，高柠檬酸盐也可以来源于一般新陈代谢。nifB编码一种自由基S-腺苷甲硫氨酸依赖酶，该酶在组装FeMo和FeV辅因子的8Fe核心中起核心作用。与NifDK和VnfDK同源的NifeN和VnfeN为辅因子的最终成熟提供了支架，还有钒和铁固氮酶特异性调控基因。最后，固氮酶需要还原铁氧化还原蛋白或黄素的形式来提供一个低势电子的来源来进行活性调节，有几种类型的酶可以实现这一点，其中一些酶可能与nif基因协调调节。其中包括丙酮酸-黄曲霉毒素氧化还原酶、电子分叉的FixABCX系统和膜结合的RNF系统。

一般来说，vnfHDGK结构基因和vnfEN组装基因在特定的微生物中被发现是共调控的，并且共调控基因通常也包括V运输系统的基因。铁固氮酶的结构基因作为anfHDGK在不同的基因组中聚集在一起，但没有报道anfEN组装基因的实例（图3）。这项初步的研究表明，一些nif基因参与了VFe和FeFe辅因子的合成，有时还需要一些用于酶组装的nif基因来产生功能性的替代固氮酶。已有研究巧妙地展示了合成铁固氮酶所需的最小nif基因集。他们利用棕色假单胞菌的anf基因和催产克雷伯氏菌的nif基因，设计并合成了具有活性的铁固氮酶。研究小组发现，除了anfHDGK外，nifUSVB基因也是合成功能性铁固氮酶所必需的。有趣的是，在重组大肠杆菌系统中提供支架基因nifEN或vnfEN并不能提高铁固氮酶的活性，这表明它们不是FeFe辅因子合成所必需的。有可能是anfDK扮演了这个角色。这些实验清楚地表明合成钼固氮酶所需的、受钼固氮酶调控的基因也是铁固氮酶合成所必需的，从而解释了为什么只有铁的固氮酶只存在于也合成钼固氮酶的微生物中。钒固氮酶的情况也是如此，据目前所知，钒固氮酶至少需要NifB。

底物范围

钼固氮酶的一个重要特征是它能减少大量的底物，除了还原N2和质子。早期对提纯的钼固氮酶的研究表明，它在一个双电子/双质子反应中将气体乙炔（HC≡CH）还原为乙烯（H2C = CH2）。由于N2还原为NH3的测定在技术上存在困难，特别是在体内，乙炔还原试验已成为测定固氮的标准方法。除乙炔外，还有一长串含氮、硫和碳的小分子可以被钼固氮酶还原，其中许多是非生理性质的。许多这类研究是体外用纯化的固氮酶和在存在的其它金属催化剂进行的。不同的固氮酶的底物分布几乎没有被彻底研究过。钒固氮酶提供的一氧化碳（CO）在体外产生C2和C3碳氢化合物。紫藤中表达的钒固氮酶也将CO还原并连接成碳氢化合物。钼固氮酶，可能还有其它的固氮酶，能将二氧化碳（CO2）还原为甲酸。钒和铁固氮酶能将CO2还原为CH4，而铁固氮酶产生的CH4明显更多。

替代固氮酶的合成与活性调控

由于固氮酶需要大量的ATP和高能电子来催化，细胞只有在绝对需要的时候才合成这些酶来提供可用的氮。因此，固氮酶的合成和活性在转录和翻译后水平上受到固定氮源的全面抑制，尤其是NH3。固氮酶对氧也极其敏感，这可能解释了为什么许多固氮微生物是专性厌氧菌。然而并不是所有的固氮菌都是这样，一些细菌根据种类的不同，控制着固氮酶的合成以响应氧。钒和铁固氮酶的合成通常也受钼有效性的控制。

氧防护

研究过的钒或铁固氮酶种类很少，仅包括文氏假单胞菌（A.vinelandii）和几种紫色非硫细菌，如荚膜红假单胞菌、红色红螺菌和沼泽红螺菌，均为α变形菌。文氏假单胞菌之所以吸引人，是因为它是一种必须好氧的细菌，在氧气中生长似乎与活性固氮酶的表达相反。事实证明，棕色拟青霉有几种保护固氮酶不被氧气灭活的机制。一种是呼吸保护，即通过多种末端氧化酶的高呼吸活性来保持固氮酶所在的细胞质处于缺氧状态。关于这一机制到底有多重要还存在一些争议，但它可能确实发挥了一些作用。第二种机制是构象关闭，一个小的[2Fe：2S]铁氧还蛋白（也被称为FeSII或Shethna蛋白）与NifHDK固氮酶复合体结合，迫使它进入不活跃但耐氧的状态，以在高氧环境中存活。这种蛋白是否也能灭活其它钒和铁固氮酶似乎还没有得到测试。棕色拟青霉anf基因簇包含一个基因（avin_49040，也称为anf3），它编码一种黄烷细胞色素，可以作为耗氧氧化酶发挥作用，这表明它可能在保护铁固氮酶免受氧的影响方面发挥特殊作用。

紫色非硫变形杆菌是一种兼性厌氧细菌，它们以异养细菌的形式好氧生长，而以光营养细菌的形式厌氧生长。在这种情况下，它们能从光能中产生ATP，并在固氮条件下生长良好。这表明，从理论上讲，这类细菌不应该需要保护其固氮酶免受氧气的伤害。然而，有报道称紫色非硫细菌在微氧生长过程中发挥固氮作用。与此相一致的是，荚膜红假单胞菌和沼泽红假单胞菌都与Avin_49040同源，Avin_3A是由anf3编码的一种黄色细胞色素，可能在耗氧中起作用。在沼泽立克次体中，该基因（rpa1432）在只表达铁的固氮酶的细胞中高度表达，而在表达钼固氮酶的细胞中几乎检测不到。而在荚膜红假单胞菌中，anf3（RCasp_Rcc012094）是唯一依赖铁的固氮酶生长所必需的。沼泽红假单胞菌和荚膜红假单胞菌也都编码Shethna蛋白II（FeSII）的同源物。该蛋白（RPA1928）在使用三种固氮酶中的任何一种生长的沼泽立克次体菌株中都有高水平表达。

氮利用效率调节

在自生变形杆菌中，固氮酶基因的表达是由通常参与氮代谢的调控蛋白层次控制的。因此，像大肠杆菌这样的非固氮菌调节氮代谢的开创性工作是理解固氮酶是如何调节的基础。从对大肠杆菌的研究中我们知道，自由生活的变形菌通过2-氧代谷氨酸（2-OG）和谷氨酸之间的比率来感知其细胞内的氮状态，这通常反映在被称为PII蛋白的小三聚体信号蛋白的尿苷基化状态上，该蛋白与其它蛋白结合以调节其活性。2-OG还可以直接与蛋白质结合以调节其活性。许多固氮变形菌有两个或三个PII蛋白，通常称为GlnB和GlnK或GlnB、GlnK1和GlnK2。当2-OG水平较高（氮不足的标志）时，一种名为GlnD的双功能尿苷酸转移酶/尿嘧啶脱除酶将尿苷酰基（UMP）基团添加到PII蛋白中，当2-OG水平较低且细胞有足够的固定氮时，它会从PII-UMP中去除尿苷酰基。由组氨酸激酶和反应调节子组成的NtrBC双组分调控系统的活性由PIIb蛋白（通常为GlnB）控制，因此当细胞以NH3作为唯一氮源生长时，PIIi不会尿苷化，因此它与NtrB结合以抑制其自身磷酸化并激活其磷酸酶活性。然而，在固氮条件下，当细胞缺乏氮时，会形成PII-UMP，在这种形式下，PII不与NtrB结合，从而允许它磷酸化NTRC。NTRC-P然后激活与氮代谢有关的各种基因的表达，包括glnK1、glnK2/NH3转运蛋白基因、谷氨酰胺合成酶基因或NifA（图4）。NifA是一种增强子结合蛋白，是细菌固氮酶基因表达的主要调节因子。它有一个N-末端的GAF结构域，一个中央的AAA+结构域和一个C-末端的螺旋-转角-螺旋结合域（图5）。在被研究的细菌中，在固氮条件下生长的细胞中，NifA的表达仅高出大约三倍。在A.vinelandii中，nifA不受NtrBC控制，而是组成性表达，另一种同样组成性表达的蛋白称为NifL，通过与NifA蛋白结合来调节翻译后的NifA蛋白。在氮过量的条件下，GlnK与NifLK复合体结合以使其失活。在高氧条件下，具有PAS结构域的nifL也会使NifA失活。因此，当满足氮限制和低氧条件时，NifA是活性的。而在其它细菌中，如光R. rubrum和R. palustris中，当PII-UMP（GlnB）与其N-末端GAF结构域结合时，NifA被激活。事实上，R. palustris nifA的q-连接区的突变或小的缺失，称为nifA∗突变，使NifA在构成上活跃，从而使细胞表达当在没有氮气的情况下，以NH3作为唯一氮源生长时产生固氮酶和H2。这些q-连接子突变可能使NifA得以展开，从而使其始终处于活跃状态（图5）。

图4.Rhodopseudomonas palustris在氮饥饿反应中三种固氮酶的合成和活性调控模型

图5.NifA蛋白的结构域示意图。

钼或氮极度饥饿在替代固氮酶表达和活性中的作用

与NifA同源的蛋白质称为vnfA和anfA，控制着vnfHDGK和anfHDGK基因在已被研究的细菌中的表达，这些细菌都是变形菌。要表达vnfA和anfA，必须满足氮饥饿的条件。但除此之外，还有钼、钒和极端氮饥饿的调控。

重要的是，虽然通常认为这三种固氮酶同功酶的表达是相互排斥的，但事实并非如此。在R. palustris中，Mo和Fe固氮酶在低Mo条件下共同表达；而在R. palustris中，钼固氮酶失活和V存在时，Fe和钒固氮酶共表达。

研究了钼酸根离子（MoO42−）对R. capsulatus固氮酶合成的调节作用。转录因子MopA和MopB编码于其固氮基因簇中，MopA和MopB是类似于大肠杆菌模式的转录抑制因子，在其C端有一个钼酸盐结合域，N端有一个螺旋-转螺旋的DNA结合域。钼的结合增强了MopA和MopB蛋白对含有DNA共有序列钼box的靶启动子的亲和力。以这种方式被转录抑制的基因之一是anfA。许多其它固氮微生物编码替代固氮酶，包括A.vinelandii，M.acetivorans和紫色非硫细菌Phaeospirillum fulvum、Rhodbacter Maris、Rhodommicrobium vannielii，所有在它们的vnfA启动子（如果存在）和anfA基因或操纵子的启动子区域保守钼box。这表明，在这些物种中，钼的有效性抑制了另一种固氮酶的表达，其方式类似于在R. capsulatus中看到的方式。在A.vinelandii的研究中，Mo直接显示了对anfA和vnfA转录的抑制作用。

紫色非硫细菌 （R.palustris）和红色红假单胞菌（R.rubrum）对钼的反应不调节anfA的转录，而是在钼固氮酶不活跃的情况下合成活性铁固氮酶，例如由于其结构基因的突变，而与生长介质中钼的水平无关。沼泽藻中钒固氮酶的表达也是如此。此外，在沼泽红曲霉中，anfA和vnfA基因之前没有Mo盒，尽管Mo转运子之前有钼盒。沼泽罗非鱼vnfA与NifA的同源性为70%，而其氨基酸序列的同源性仅为36%。当氮源为氮源时，anfA和vnfA基因分别上调约70倍和30倍，在钼固氮酶不表达的情况下，anfA和vnfA基因分别上调约70倍和30倍。并且anfHDGK和vnfHDGK结构基因也上调。这表明当anfA和vnfA蛋白被表达时转录其目标基因是活跃的。与NifA的情况不同，它们不再需要采取主动构象来精通转录（图4）。现有证据表明，在氮缺乏条件下anfA和vnfA的表达被激活，这种条件比激活NifA转录所需的条件更极端。其机制尚未确定，但根据已知的一般氮代谢情况，可能与2OG水平升高或超尿酸化PII化蛋白有关。一些转录实验表明，NifA能激活沼泽红假单胞菌中anfA和vnfA的表达，但还必须有其它要求，因为表达活性NifA∗蛋白的菌株不表达替代固氮酶。

翻译后调控

当生长介质中的NH3或能量突然下降时，某些变形菌会立即关闭钼固氮酶的活性。其机制是一个保守的精氨酸在NifH（二氮酶还原酶）上进行翻译后ADP-核糖基化。这阻止了NifH与NifDK的相互作用，从而抑制了电子转移和固氮酶活性。这种修饰是可逆的，由固氮酶还原酶、ADP-核糖基转移酶（DraT）和固氮酶还原酶激活糖水解酶（DraG）催化。在包括R. capsulatus在内的紫色非硫细菌中已发现AnfH的ADP-核糖基化和R.Parustris的VnfH的ADP-核糖基化也存在于R. palustris中。

AnfH与NifH的差异比VnfH大得多，氨基酸同源性约为45%。但R. palustris的NifH、VnfH和AnfH至少在同一相对位置都有保守的精氨酸，这是ADP-核糖基化的位点。R. palustris anf基因簇包括一个draT1基因（rpa1431），该基因与anfHDGK基因协同调控。还有一个draT2基因是结构性表达的，它介导钼固氮酶活性的关闭，并与染色体上的draG2基因配对。在所有研究的案例中，固氮酶翻译后修饰的Drag-DRAT系统都是由PII蛋白控制的（图4）。

自然界中钒和铁固氮酶的活性

由于缺乏关于替代固氮酶在自然界中固氮作用的信息，阻碍了对生物氮循环的全面认识。大量的间接证据表明，只有V和Fe的固氮酶可能是有活性的。钼是地壳中最稀缺的微量元素，在实验室培养的钼限制条件下，编码替代固氮酶的细菌似乎总能表达功能酶。此外，替代固氮酶基因在蓝藻细菌地衣共生体、白蚁后肠和用V改良的土壤微生态中也有表达。

直接评估替代固氮酶活性的一个问题是，直到最近还没有一种简单的方法来测量和区分环境样品中钼和替代固氮酶的活性。同位素乙炔还原法（ISARA）是一种有价值的新方法，它是通过观察三种固氮酶对15N/14N天然丰度进行不同程度的分割，替代固氮酶与钼固氮酶相比，显著降低了15N/14N的比值。事实证明，Mo和选择固氮酶在乙炔还原试验中对乙炔的13C/12C丰度的分级也不同。这可以通过气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法检测13C乙烯的同位素丰度来测定。13C乙烯是由氮化酶还原乙炔的产物。替代固氮酶的另一个诊断特征是，作为乙炔还原的产物，它们催化乙烷和乙烯的生成，铁固氮酶比钒固氮酶产生更多的乙烷。另一方面，钼固氮酶将乙炔完全还原为乙烯。

在实践中，需要有相当高的固氮酶活性才能检测乙烷或使用ISARA，这可能会限制广泛的环境调查。然而在某些环境中，这些检测提供了替代固氮酶活性的证据。在一项研究中，ISARA对大沼泽地国家公园的落叶样本和大西佩维塞特沼泽的沉积物样本的测量表明，存在活跃的替代固氮酶，这些样本还含有anfD和vnfD基因。这些测量很可能包括了沉积物样品中所有三种固氮酶活性的贡献，因此只能得出结论，单靠钼固氮酶不能解释所获得的乙炔碳同位素分馏值，而且一定有一部分固氮酶是由铁和钒固氮酶贡献的。因此只能得出这样的结论：仅有钼固氮酶不能解释所获得的乙炔碳同位素分馏值，而一定有一部分固氮酶是由铁和钒固氮酶贡献的。该研究估计，在叶凋落物和沼泽沉积物中测得的乙炔减少量中，分别有24%和18%是由于替代固氮酶活性所致。

第二项更广泛的研究考察了钒固氮酶对北方森林蓝藻生物固氮的贡献。北极圈森林占据着亚北极，主要是桦树、杨树和针叶树等植物，这些植物并不是已知的固氮共生体的宿主。这些森林和它们的土壤储存了大量的碳，固定氮的可用性被认为是一个可能限制它们吸收未来人为增加的大气二氧化碳的能力的因素。此外，据报道，蓝藻为亚北极白桦林贡献了85%以上的固定氮。在这里，蓝藻是真菌和蓝细菌（通常是念珠藻属）之间的共生组合，念珠藻属是一种已知能表达活性钼和钒固氮酶的属。在加拿大东部一条纵向横断面上的北方蓝藻样本中，有一半的样本具有替代固氮酶活性。由于蓝藻编码V而不是铁固氮酶，因此作者得出结论，所有测得的活性都归因于V替代固氮酶。并且我们测定了地衣营养部分（叶状体）的钼含量，发现钼含量与钒固氮酶的平均活性呈负相关。这些结果表明，高达50%的总固氮可能是由于V而不是钼固氮酶的活性。人们预计还将开展其它研究，以评估替代固氮酶对全球固氮的贡献。

固氮酶除固氮外的作用

固氮的极端能量要求反映在哈伯-博世工业过程中将N2转化为NH3作为肥料的要求。这一过程需要200个大气压和400°C的压力，才能使用铁催化剂将N2+H2转化为NH3。这一反应是由生活在1个大气压和30°C的微生物完成的，这是值得注意的。同时，由于固氮酶的复杂性，除固氮外，固氮酶还发生催化反应，最主要的是产氢。在NAD或NAD等电子载体的氧化过程中，H2的产生起着重要的作用。在新陈代谢过程中，尤其是在厌氧代谢过程中减少的铁氧还蛋白。例如，紫色非硫细菌不会生长在比细胞生物量更低的碳化合物（如丁醇）上，除非它们是在固氮条件下生长的，以允许产生氢气作为缓解过量还原当量的一种方式。许多发酵细菌如果被允许使用质子作为电子受体来产生氢气，就可以产生更多的ATP。这会增加细胞用来固定氮的三磷酸腺苷（ATP）的量。另一种可能有用的产物是CH4，它是R. palustris、R. rubrum、R. capsulatus和A. vinelandii的细胞在固氮条件下用铁固氮酶培养时产生的。这一环节产生的甲烷数量很少，但足以支持专性利用甲烷的甲基单胞菌菌株在共培养中的生长 （图6）。

结论

替代固氮酶在细菌和古细菌中的广泛存在，以及越来越多的证据表明它们在自然界中的高表达和活性支持了替代固氮酶是安全酶并可以替代钼固氮酶支持全球生物固氮的观点。故障保护一词不应被理解为不重要。人们越来越认识到，在某些生态系统中，钒和铁固氮酶可能在固氮中发挥重要作用。此外，这些替代固氮酶可能在支持微生物和微生物群落方面发挥辅助作用，这些微生物和微生物群落依赖于H2作为氧化还原释放机制，而CH4作为碳源。

本文要点

1. 固氮酶有三种形式：钼固氮酶、钒固氮酶和铁固氮酶。

2. 钼固氮酶最先出现，是三种酶中将N2转化为NH3效率最高的酶。

3. 仅含钒和铁的替代固氮酶被认为是细菌和古菌在钼限制时使用的后备酶。

4. 仅含钒和铁的固氮酶在其活性部位含有VFe和FeFe辅助因子，而不是钼铁辅助因子。

5. 这两种交替固氮酶只存在于也含有钼固氮酶的微生物中。

6. 钒和铁固氮酶在环境中具有活性，钒固氮酶可能对亚北极陆地地区的全球生物固氮起作用。

7. 铁固氮酶产生大量的甲烷，这可能支持自然界中微生物群落的生长。

8. 三种固氮酶都能产生相当数量的氢气。

展望

1. 产甲烷古菌和鞭毛虫，尤其是梭状芽胞杆菌中的钒和铁固氮酶的生理和调控几乎一无所知。

2. 对替代固氮酶表达调控的分子机制知之甚少，尤其是在不通过钼酸盐抑制来调控基因表达的细菌中更是如此。

3. 可被替代固氮酶还原的小分子的全部范围尚不清楚。

4. 与钒和铁固氮酶结构基因协同调控的基因有5~20个，但它们的功能大多未知。

5. 仅含V和Fe的固氮酶对全球氮循环的贡献尚未得到系统的研究。

6. 只表达铁固氮酶的微生物可能通过产生CH4和NH3来影响微生物群落的相互作用，但这一点还有待探索。

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