猪流行性腹泻是猪的严重传染病之一,症状与猪传染性胃肠炎相似,病毒形态上也基本相同,但两者的抗原性不一样。本标准是根据国内研究成果和参考国外同类研究成果编写的。
本标准的附录A、附录B、附录C均为规范性附录。
本标准由农业部畜牧兽医局提出。
本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国人民解放军军需大学。
本标准主要起草人:马思奇、王明、宣华、冯力、佟有恩。
1范围
本标准规定了猪流行性腹泻(PED)的病毒分离鉴定与检测病毒抗原的直接免疫荧光法、双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA),检测抗体的血清中和试验、间接ELISA试验技术。
本标准适用于对猪流行性腹泻的诊断、产地检疫及流行病学调查等。
2病毒分离与鉴定
2.1材料准备
2.1.1器材
倒置显微镜,冷冻离心机,微孔滤器,细胞培养瓶,盖玻片,温箱等。
2.1.2培养基及溶液的配制
磷酸盐缓冲液(PBS)、细胞培养液、病毒培养液及N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES)液(配制方法见附录A)。
2.1.3细胞
Vero细胞系。
2.2病毒分离
2.2.1病料采集
采病仔猪空肠内容物及小肠内容物用于分离病毒,样品冷冻保存。
2.2.2病料处理
将采集的小段空肠连同肠内容物用含1000 IU/mL青霉素、1000μg/mL链霉素、PBS液制成5倍悬液,在4℃条件下3000r/min离心30min,取上清液,经0.22μm微孔滤膜过滤,分装,-20℃保存备用。
2.2.3接种及观察
将过滤液(病毒培养液的10%)接种于Vero细胞单层上,同时加过滤液量50%的病毒培养液,37℃吸附1h,根据组织培养瓶大小添加病毒培养液至病毒培养总量,置37℃培养,逐日观察3d~4d,按致细胞病变作用(CPU变化情况,可盲传2代~3代。
2.3结果判定
CPE变化的特点是:细胞面粗糙,颗粒增多,有多核细胞(7个~8个甚至几十个),并可见空斑样小区,细胞逐渐脱落,这是特征性的CPE,可与(猪)传染性胃肠炎(TGE)病毒的CPE相区别。同时在细胞培养瓶中加盖玻片,收毒后用直接荧光做鉴定试验。有条件时可进行电镜观察,用负染法在阳性样品中电镜观察可见到冠状病毒粒子。
3直接荧光抗体法
3.1材料准备
3.1.1器材:荧光显微镜、冷冻切片机、载玻片、盖玻片、温箱、滴管等。
3.1.2荧光抗体(FA)。
3.1.3溶液配制:磷酸盐缓冲液(PBS)、0.1%伊文思蓝原液、磷酸盐缓冲甘油(配制方法见附录B)。
3.2操作方法
3.2.1标本片的制备
3.2.1.1组织标本
采急性期内(5d~7d)患猪空肠中段的粘膜上皮做涂片或肠段做冷冻切片(4μm~7μm),丙酮中固定10min ,置PBS中浸泡10min~15min,风干或自然干燥。
3.2.1.2细胞培养盖玻片
将分离毒细胞培养24h~48h的盖玻片及阳性、阴性对照片在PBS中冲洗数次,放入丙酮中固定10min ,再置于PBS中浸泡10min~15min,风干。
3.2.2 FA染色
3.2.2.1用0.02%伊文思蓝溶液将FA稀释至工作浓度(1:8以上合格)。
3.2.2.2 4000r/min离心10min,取上清液滴于标本上。
3.2.2.3 37℃恒温恒湿染色30 min ,用PBS冲洗3次,依次为3min、4min、5min,风干,滴加磷酸盐缓冲甘油,盖玻片封固,荧光显微镜检查。
3.2.3结果判定
判定标准:在荧光显微镜下检查,被检标本的细胞结构应完整清晰。并在阳性、阴性对照均成立时判定。在胞浆中见到特异性苹果绿色荧光判定为阳性,如所有细胞浆中无特异性荧光判定为阴性。
可根据细胞内荧光亮度强、弱分别作如下记录:
a)++++:呈闪亮苹果绿色荧光;
b)+++:呈明亮苹果绿色荧光;
c)++:呈一般苹果绿色荧光;
d)+:呈较弱绿色荧光;
e)-:呈红色。
结果为a)~d)者均判为阳性。
4双抗体夹心ELISA
4.1材料准备
4.1.1器材:定量加液器、微量移液器及配套吸头、96孔或40孔聚乙烯微量反应板、酶标测试仪。
4.1.2猪抗PED-IgG及猪抗PED-IgG-HRP(HRP为辣根过氧化物酶)。
4.1.3溶液配制:洗液、包被稀释液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物溶液、终止液〔配制方法见附录C〕。
4.1.4待检样品:发病仔猪粪便或肠内容物,用浓盐水1:5稀释,3000r/min离心20min,取上清液待检。
4.2操作方法
4.2.1冲洗包被板
向各孔注入无离子水,浸泡3min甩干,重复3次,甩干孔内残液,在滤纸上吸干。
4.2.2包被抗体
用包被稀释液稀释猪抗PED-IgG至使用倍数,每孔加100μL,置4℃过夜,弃液,用洗液冲洗3次;每次3min。
4.2.3加样品
将被检样品用样品稀释液(见第C.3章)做5倍稀释,加入两孔,每孔100μL,每块反应板设阴性抗原、阳性抗原及稀释液对照各两孔。置37℃作用2h,弃样品,冲洗同4.2.2。
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