猪流行性腹泻病毒的基因结构及其诊断技术
范京惠 左玉柱 任晓峰
1.河北农业大学动物医学院；2.东北农业大学动物医学学院
1引言
猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDvirus，PEDV）引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病，本病多发于冬春季节，不同年龄和不同品系的猪对其均易感，但以哺乳仔猪发病和死亡最为严重。PED于1971年首次爆发于英格兰的架子猪和育肥猪群。1978年由Debouck等从患病猪的病料中分离出该病的病原，命名为CV777株，并证实其对哺乳仔猪和育肥猪均有致病性，而后匈牙利、西德、加拿大、韩国、日本等国相继报道有本病的发生。至今在北美和南美还未能证明PEDV的存在，近年来，该病主要流行于亚洲国家如韩国、中国和日本等国，欧洲各国虽然仍有PED的发生，但在哺乳仔猪的流行日渐减少，主要集中在架子猪、育肥猪和青年种猪，死亡率很低，而在亚洲，则发生了可感染所有日龄且哺乳仔猪高死亡率的PED，危害较为严重。1994年对韩国7个省屠宰场的469份血清进行血清学检测发现，PEDV的抗体平均阳性率为45%，表明PEDV在韩国一些地区呈地方性流行1993-09/1994-06，在日本流行的PED，导致的哺乳仔猪死亡率为30%~80%。~泰国发生的PED，则导致近100%的感染仔猪死亡，我国于1980年首次分离到PEDV，其后许多地区均报道有该病的发生，杨群等对来自10省市的158份临床猪粪样的检测结果表明，我国很多猪场普遍存在PEDV,其感染率达53.2%。于晓龙对113份疑似PEDV的病料进行检测，结果38份样本表现为PEDV阳性，阳性率为33.6%。对华南6个省48个猪场的127份样本检测，PEDV的阳性率为43.0%。而在河北省流行的仔猪腹泻中，PEDV的阳性率为62.2%，部分猪场感染PEDV的哺乳仔猪死亡率高达100%。近年来，该病的流行区域有逐渐扩大的趋势，而且在PEDV疫苗免疫的猪群亦不断发生，给养猪业造成了严重的经济损失，对PED进行确诊以及监测是防控该病的重要环节，由于PED与猪传染性胃肠炎（transmissiblegastroenteritisofswlne，TGE）在流行病学、临床症状、病理变化以及病毒形态等方面非常相似，临床鉴别诊断困难，故确诊需要结合试验室诊断方法，本文就目前PEDV的分子生物学特点及实验室诊断方法方面进行综述。
2PEDV基因组结构及功能
PEDV属于冠状病毒科、冠状病毒属，痛毒基因组为不分节段的单股正链RNA，具有感染性，整个基因组为28033nt，5＇端有一个帽子结构（cap），3＇端有一个poly（A）尾，5＇端的非翻译区长296bp，包含一个65nt~98nt的前导序列、1个以AUG为起始密码子、并拥有Kozak序列(GUUCAUGC)，3＇端非翻译区长334nt，含有由8个碱基（GGAAGAGC）组成的保守序列，起始于poly（A）上游的73nt处，其余的基因组包括至少7个开放阅读框（ORFs），分别编码4种结构蛋白（纤突蛋白S、小膜蛋白E、膜糖蛋白M和核衣壳蛋白N）和3种非结构蛋白（复制酶多聚蛋白Pol（la/lb）和（ORF3蛋白），在基因组上的排列顺序为：5＇-Pol（la/lb）-S-ORF3-E-M-N-3＇，每相邻两基因之间存在有间隔序列，复制酶多聚蛋白基因占全基因组的2/3，包括2个开放阅读框ORFla和ORFlb，二者之间有46nt的重叠序列，重叠处有滑动序列（UUUAAAC）和假结结构，能使核糖体进行移码阅读，从而保证Pol基因的正确翻译，位于E基因与S基因之间的ORF3，编码一个未知功能且具有多态性的产物，不同的冠状病毒，其大小和序列不同。
2.1S基因及S蛋白功能特性
S蛋白由1383个氨基酸组成，是位于痛毒粒子表面的纤突糖蛋白，含有27个~29个潜在的糖基化位点，同其他冠状病毒相似，从N端到C端分成3个结构域，即大的外部结构域、转膜结构域和短的羧基末端细胞质结构域，由于缺乏蛋白水解位点，PEDV不能像其他冠状病毒一样被切割成Sl和S2亚基，但是根据其他冠状病毒S蛋白保守的基序，也可以将PEDVS蛋白划分为Sl（第1-789位氨基酸）和S2（第790位~1383位氨基酸）2个结构域。Sl区位于蛋白的表面，能与宿主细胞上的受体结合，介导抗体尤其是中和抗体的产生，而位于病毒内部的S2区则介导病毒与宿主细胞的融合，很少介导产生特异性抗体，S蛋白羧基末端细胞质结构域主要是由疏水氨基酸组成的疏水区，对整个S蛋白起固定作用，外部结构域有介导机体产生中和抗体的抗原表位和与宿主细胞表面大分子结合的受体结合域，在病毒粒子识别靶细胞、与细胞表面受体结合并介导病毒进入以及在宿主体内诱导产生中和抗体方面具有重要作用，是研制PEDV有效疫苗的重要靶抗原，Chang等根据TGEVS基因的中和表位区序列信息，初步鉴定了PEDVS基因一个抗原表位区（第499位~638位氨基酸）；Cruz等利用嗌菌体随机肽库，鉴定了PEDVS蛋白的一个模拟表位（第1368-1374位氨基酸）；Sun等利用制备的6株PEDVS蛋白特异性单克隆抗体对构建的PEDVSl基因特异性肽库进行淘选，并结合肽扫描技术，最终鉴定2个中和表位（748位~755位氨基酸和764-771位氨基酸），为表位疫苗的研制奠定了基础，研究发现，氨基肽酶（aminopeptidaseN，APN）是冠状病毒的感染受体，属于I群冠状病毒的猪传染性胃肠炎病毒（transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV）、人冠状病毒229E、猫冠状病毒等均以各自宿主的氨基肽酶作为细胞感染受体，PEDVS蛋白第249位~529位氨基酸区域则是pAPN细胞受体的一个潜在的结合区域。
依据S基因可确定PEDV不同分离株之间的遗传、进化关系等，Park等比较了45个韩国分离株的S基因上651bp的基因片段，结果显示核苷酸相似性在88.7%~96.7%之间，另有研究表明，感染PEDV猪的血清中，抗S蛋白的抗体比抗N蛋白的抗体更为持久，可在更长的时间内检测到抗S蛋白的抗体，而且PEDV的S蛋白与TGEVS蛋白的同源性非常低，二者在血清学上没有交叉反应，为以检测S蛋白抗体为基础的PEDV检测方法的建立提供了依据。
2.20RF3基因及ORF3蛋自功能特性
ORF3基因编码尾部有6个His，具有223或224个氨基酸的非结构蛋白，其功能目前了解较少，已知ORF3至少存在3个可变区，每个可变区都有2个~7个核苷酸的缺失，缺失试验证明，ORF3的产物对在体外细胞培养中的病毒复制来说是非必需的，相反，该蛋白的表达，会降低病毒体外培养的适应性，已有研究显示，ORF3与病毒毒力有关，Song等通过对野生型和致弱毒株ORF3序列进行比较，发现经过致弱后的毒株均有17个氨基酸的缺失，该缺失可作为病毒适应细胞和弱化的一个重要标志，因此，可通过检测ORF3基因的差异，对PEDV进行流行病学研究，同时该缺失也为强弱毒株鉴别诊断方法建立提供了依据。
2.3M基因及M蛋白功能特性
M基因全长681bp，编码由226个氨基酸组成的结构蛋白，该基因高度保守，对M基因的序列比较分析表明，CV777和Brl/87核苷酸序列仅有1个核苷酸的差异，黑龙江地方分离株LJB/03的M基因序列与其他己公布发表的各地方分离株的同源性均在96%以上，Chen等分离的6株PEDV之间的M基因核苷酸同源性为98.8%~100%，与参考毒株的同源性为97.2%~99.4%，Li等对我国华南地区分离的毒株M基因核苷酸进行比较，同源性为96.1%~100%，Fan等从河北省分离的7株PEDV之间M基因同源性为99.4%~99.9%。且与韩国和泰国毒株的关系较近，以上研究表明，M基因高度保守，这为以检测M基因为基础的PEDV检测方法建立奠定了基础。
M基因编码的M蛋白在病毒粒子的组装和出芽过程中具有重要作用，是一种跨膜糖蛋白，在补体存在的条件下，抗M蛋白的单克隆抗体能中和病毒的感染性，另外，M蛋白能介导机体产生仪干扰素，因此M蛋白可以作为PEDV基因工程疫苗的候选抗原。
2.4N基因及N蛋白功能特性
PEDV的N基因高度保守，CV777和Brl/87两个分离株N基因序列仅有2个碱基的差异，LJB/03株与其他毒株的同源性也均在95%以上，N蛋白为磷酸化的核衣壳蛋白，在病毒RNA合成过程中发挥重要作用，且N蛋白在PEDV的结构蛋白中所占比例最大，在感染的细胞中能得到大量表达，猪在感染PEDV的早期，体内就能产生抗N蛋白的高水平抗体，所以利用N蛋白来建立PEDV诊断技术具有很好的应用前景。
3PED诊断技术
由于PED的临床症状和病理变化与TGE极为相似，因此PED的确诊需要进行实验室诊断，病毒分离、免疫电镜观察、病毒的中和试验、免疫荧光技术等都已用于PEDV抗原或其抗体的检测，这些方法均能对PED做出准确的诊断，但这些技术操作复杂而且耗时。随着分子生物学的发展，PCR和ELISA等技术已应用到PED诊断技术中。
3.1PCR技术
Ishikawa等根据S基因序列设计了一对可扩增854bp目的片段的引物，成功地建立了诊断PEDV的RT-PCR法，Kubota等和Jung等以M基因和N基因为靶基因建立了RT-PCR方法来检测PEDV，在粪便样品中能检测到PEDV的最低含量为100TCID50/mL。在韩国已建立了TGEV和PEDV的二联RT-PCR诊断方法，可同时检测出10TCID50/mL的TGEV和PEDV。Kim等还建立了鉴别TGEV和PEDV的多重巢式RT-PCR法，此方法适用于检测福尔马林固定的组织，以原位杂交法作对照，结果显示二者检出率完全一致。Song等建立了鉴别诊断PEDV、TGEV和猪轮状病毒的多重反转录PCR（Multi-RTPCR），为鉴别3种病毒性腹泻病原的混合感染提供了技术支持，同时又建立了检测PEDV的实时荧光定量PCR，对仔猪体内PEDV的病毒载量进行了定量。Lee等建立的一步法多重RT-PCR技术，可快速区别检测PEDV，BenSalem等建立的多重巢式RT-PCR法，可检测lOOTCID50/mL的TGEV、10TCID50/mL的PRV和27.2mg/mL的PEDVRNA，为猪肠炎病毒检测提供了一种快速、敏感的诊断方法，以上RT-PCR方法的建立，为PEDV的实验室检测提供了有效的方法，但由于RT-PCR需要使用PCR仪，且需要专业人员进行操作，所以该方法不便于在猪场大面积推广应用。
3.2RT-LAMP技术
RT-LAMP是以RT为基础的环介导等温扩增技术，该方法可在等温的条件下进行自动循环的链置换核酸扩增反应。Ren等建立的RT-LAMP方法既能从临床病料中检测PEDV，又能区分TGEV、PRV、PRRSV及猪的伪狂犬病毒，比RT-PCR技术及ELISA方法更为敏感。
3.3ELISA方法
酶联免疫吸附试验（ELISA）法既可直接检测抗原，又可检测血清中的抗体，在许多疫病的诊断和检测中广泛应用，由于PEDV的体外培养较为困难，近年来产生了以蛋白为基础的ELISA.Knuchel等以制备的PEDVS蛋白和N蛋白为抗原，建立了检测PEDV扰体的ELISA，并发现S-ELISA更为有效，可在感染后更长时间检测出猪体内PEDV抗体.Oh等用建立的间接ELISA方法对48个猪场的1024份样品进行检测，结果与中和试验（SN）的符合率为84.2%。且该ELISA方法具有比SN高的敏感性和特异性。Hou等在大肠杆菌中表达的重组N蛋白建立的ELISA方法，特异性和敏感性分别为98.7%和98.0%，对884份临床样本进行检测，与SN的符合率为88.3%，为PEDV的抗体检测提供了手段。Rodak等利用PEDVM蛋白的单克隆抗体建立了敏感性强、特异性高的竞争阻断ELISA诊断方法。Sozzi等用以单克隆抗体为基础建立的双抗体夹心ELISA方法，对采自不同猪场具有肠炎症状的仔猪粪便样本506份进行PEDV检测，并与RT-PCR方法进行比较，结果二者具有很高的相关性，为PEDV的流行病学研究提供了一种有效的方法。Ren等等在大肠杆菌中表达的M蛋白纯化后免疫健康家兔，制备抗M蛋白的多克隆抗体，免疫荧光检测分析，制备的抗体可从不同肠炎病毒感染的细胞中检测出PEDV，而且用该抗体建立的间接ELISA方法。不与TGEV、AIBV、PRRSV、CSFV及PRV等反应，尽管以上研究已经建立了PEDV及其抗体的相关ELISA检测方法，但目前国内尚未有商品化的ELISA试剂盒可用，需要在ELISA检测方法的特异性、敏感性和稳定性等方面进一步研究。
3.4免疫层析法
胶体金免疫层析试验是将免疫胶体金技术与层析分析技术有机结合起来，建立的一种快速免疫学检测技术，本法简便、快速，可在几分钟内观察结果，已成为目前最主要的快速免疫分析方法之一，在畜禽疾病诊断疫情监测方面亦具有巨大的发展潜力和应用前景，张利勃等将葡萄球菌蛋白A（staphylococalproteinA，SPA）进行胶体金标记后作为指示介质，将基因工程表达的PEDVM蛋白抗原和自制的抗SPA多抗血清包被硝酸纤维素膜，分别作为检测线和质控线，制成了一种检测PEDV血清抗体的快速诊断试纸，与ELISA方法相比，二者具有相近的灵敏度，对75份临床样本的检测结果显示，两种方法的符合率为96%，为PEDV的抗体检测提供了一种快速、简便的方法，免疫胶体金检测试纸条由于在检测过程中不需要特殊的仪器设备，且操作简单，不需要专门的技术人员，因而该方法在猪场，特别是中小规模的猪场有较好的应用前景。
3.5RFLP方法
Song等通过RFLP（限制性酶切片段长度多态性分析）技术分析了PEDV的细胞致弱毒株DR13和地方分离毒株的ORF3，发观适应细胞的DR13毒株ORF3序列在HindⅢ和XhoII限制性酶切位点处发生了变化，该位点的差异，可用于区分PEDV细胞适应株和野毒株，亦可用于PEDV感染的流行病学研究。Lee等通过以RT-PCR为基础的RFLP技术分析了13株韩国分离株和疫苗株J-vac及CV777的N蛋白基因，发现其中11个分离株与疫苗株在AspLEI、HgaI和MspR9I限制性酶切位点有差异，对N基因进行RFLP分析有望成为区分疫苗株和野毒毒株的一种有效方法。
4结论
快速、精确的诊断是有效防控疫病的基础和必要条件，在PED的诊断方面近年来取得了很大的进展，已经有越来越多的技术应用于PED的诊断，其中ELISA和RT-PCR法是目前研究的重点，ELISA法有简便、快速、特异性强等优点，但对于抗原的纯度要求较高，PCR诊断技术灵敏度高、特异性强，但受仪器设备的制约，不适于临床推广，因此，应对已有的各种方法进行深入研究，使他们更趋完善并方便于临床应用；另一方面，随着PEDV基因组研究的深入，有关蛋白结构和功能不断揭示，也将为PEDV诊断技术的发展提供强有力的手段。
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