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文章刊于
中华肝脏外科手术学电子杂志，，9(3)：232-238.
作者：郭俊 易小猛 安玉玲 魏绪霞 范明明 黎利娟陆平兰 易慧敏 吕海金
作者单位：中山大学附属第三医院外科ICU
摘要
目的探讨人脐带间充质干细胞（HUMSCs）治疗肝移植术后难治性急性呼吸窘迫综合征（ARDS）安全性及疗效。
方法回顾性分析12月3日至12月20日在中山大学附属第三医院接受HUMSCs 挽救性治疗的10例难治性中重度ARDS肝移植患者临床资料。患者或其家属均签署知情同意书，符合医学伦理学规定。其中男8例，女2例；年龄23～69岁，中位年龄48岁。观察HUMSCs治疗安全性，并比较HUMSCs治疗前后氧合指数、肺损伤评分、肺水肿影像学评分（RALE）改变。治疗后参数变化分析采用单因素重复测量方差分析和Bonferroni法检验。
结果HUMSCs输注过程中未观察到与输注相关的不良事件。与HUMSCs输注前平均氧合指数（109±29）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）比较，输注后1 d氧合指数（235±132）mmHg明显升高（t=3.00，P<0.017）；与输注前肺损伤评分（2.9±0.6）分比较，输注后3 d肺损伤评分（1.8±0.9）分明显降低（t=-4.00，P<0.017）；与输注前RALE评分（33±5）分比较，输注后7 d的RALE评分（27±7）分明显降低（t=-4.40，P<0.017）。6例难治性中度ARDS肝移植患者，其中4例均在1周内氧合好转后顺利脱机拔管。另2例中度及4例重度难治性ARDS患者死于原发病进展。
结论HUMSCs治疗肝移植术后难治性ARDS患者安全可行，对肺损伤有显着改善。
肝移植是各种终末期肝病治疗的唯一手段。急性呼吸窘迫综合症（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是肝移植术后常见的并发症之一，其发病率约27.5%，肝移植术后ARDS显着影响移植物和患者短期存活[1]。术前肝衰竭、手术创伤、缺血-再灌注损伤、大量失血以及术后感染等是肝移植术后发生ARDS的常见危险因素。目前，肝移植术后ARDS的治疗以肺保护性通气、负液平衡等支持性治疗为主，尽管如此，中-重度ARDS病死率仍高达40%～67%[2-3]。针对保守干预失败的难治性ARDS患者，仍无特效的治疗手段[4]。由各种肺内及肺外致病因素所导致的过度肺泡炎症和弥漫性肺泡上皮、内皮损伤是肝移植术后ARDS 特征性的病理改变。炎症和损伤继发肺泡隔增厚、通气血流比例失调，继而出现临床上典型的顽固性低氧以及多器官损害[5]。抑制炎症和改善上皮和内皮细胞功能，有望促进肺损伤的修复。然而，既往多项临床研究采用抗炎、改善上皮细胞功能等药物治疗均未显着改善ARDS患者预后[6-7]。究其原因，ARDS是一类炎症和损伤相互影响的复杂综合征，单一靶点的治疗往往难以整体奏效，亟需一种多靶点的干预手段。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，兼具有抗炎、促修复作用[8]。已有大量证据表明，MSCs可通过直接接触或旁分泌作用，抑制过度的肺泡炎症和减少上皮和内皮凋亡，从而显着改善各种类型疾病模型诱发的肺损伤[9-10]。近来，两项Ⅰ期临床研究也初步验证了MSCs在ARDS人群中的安全性[11-12]。然而，在难治性ARDS的肝移植患者中，人脐带来源的MSCs（human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUMSCs）的治疗仍未有报道。本研究回顾了近年来在中山大学附属第三医院外科ICU进行了HUMSCs挽救性治疗的10例难治性中-重度ARDS肝移植患者的病例特征、治疗经过和结局，旨在初步探索HUMSCs在肝移植难治性中重度ARDS中治疗的安全性和临床价值。资料与方法一、一般资料回顾性分析12月至12月在中山大学附属第三医院外科ICU 接受HUMSCs挽救性治疗的10例难治性中重度ARDS肝移植患者临床资料。所有患者或其家属均签署由医院伦理委员会批准的患者知情同意书，符合医学伦理学规定。其中男8例，女2例；年龄23～69岁，中位年龄48岁。中度ARDS 6例，重度ARDS 4例。ARDS病因：脓毒症5例，其中病原体鲍曼不动杆菌2 例，肺炎克雷伯杆菌1例，洋葱伯克霍尔德氏菌1例；肺部感染4例，其中病原体鲍曼不动杆菌1 例；误吸1例。二、诊断及排除标准1. 中重度ARDS的诊断标准：所有入组患者均符合柏林定义提出的中-重度ARDS诊断标准[5]。具体为：（1）已知临床发病或呼吸症状新发或加重后1周内。（2）呼气末正压（positive end expiratory pressure，PEEP）设定≥5 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa） 条件下，动脉氧分压（PaO2）/ 吸氧浓度（FiO2）<200 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。（3）X 线胸片呈双肺浸润影。（4）不能由左心衰肺水肿完全解释的缺氧。2. 排除标准：年龄<18岁；ARDS发病时间大于72 h；妊娠、哺乳期或围产期妇女；恶性肿瘤患者。3. 难治性ARDS：首次诊断的中重度ARDS患者经常规治疗24 h，重度可缩短至8 h 后氧合指数仍<200 mmHg。三、常规保守治疗方案主要包括肺保护性通气、保守型液体输注。具体为：（1）肺保护性通气策略。诊断后立即开始肺保护性通气治疗，方案为小潮气量（6 ml/kg预计体重）和高PEEP。PEEP和吸氧浓度调节参照ARDSNet[13]，维持目标血氧88%～92%，二氧化碳分压<55 mmHg，平台压<30 cmH2O。必要时行深镇静和肌松并肺复张，条件允许尽早行俯卧位通气，对于氧分压持续<60 mmHg并伴有显着呼吸性酸中毒的患者，建议联系转院行体外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）治疗。（2）保守型液体输注。根据床旁超声及患者尿量、中心静脉压制定液体管理方案，应用血管活性药物维持血流动力学稳定，给予液体负平衡，同时监测中心静脉压，维持在6～8 mmHg。如果超过8 mmHg，予限制液体输入量及适当利尿治疗；具体参照简化的液体和导管治疗试验（fluid and catheter treatment trial，FACTT）容量管理方案[14]。四、UMSCs的制备和干预方法1.HUMSCs制备：研究所用HUMSCs均由中山大学附属第三医院生物治疗中心制备提供。即足月剖宫产健康胎儿脐带，经产妇知情和医院医学伦理委员会批准，取自中山大学附属第三医院手术室。无菌条件下取脐带，用PBS洗涤除去残留血液，并剥离脐动、静脉和外膜组织。将脐带剪成1 cm3小块，加入MSCs 专用培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。3～5 d后全量换液，7～10 d后去除贴块，得到生长的HUMSCs。待细胞汇合度达到90%进行消化、传代，传至3～5代后收集MSCs细胞供治疗使用。本研究所用干细胞均由生物治疗中心新鲜制备，在我们之前的研究中已描述了HUMSCs的分离、培养及鉴定[15]。2. 干预方法：输注剂量为1×106/kg，配以100 ml无菌生理盐水制成细胞悬液，采用输血器以100～200 ml/h输注速度，中心静脉输注，输注完毕后采用50 ml无菌生理盐水冲洗管路。输注开始后至输注结束后严密观察病情，及时处理并记录。五、观察指标记录输注期间和输注后24 h输注相关不良事件（infusion-associated events，IAEs）、呼吸和血流动力学参数，以及输注后28 d内肝肾功能指标；记录1、3、7 d的动脉血气分析（氧分压、吸氧浓度）、呼吸机参数（呼气末正压、平台压、潮气量）、影像学资料，并留取肺泡灌洗液和血浆标本，检测炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-8）、上皮损伤及内皮损伤指标。记录患者28 d内肝、肾循环等多器官功能，及ICU住院时间及生存结局。上皮损伤指标包括晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end-products，RAGE）、表面活性蛋白D（surfactant protein D，SP-D），内皮损伤指标包括血管生成素2（angiopoietin 2，Ang-2）。1. 主要结局指标：IAEs发生率。IAEs定义为开始输注期间和输注后6 h内患者病情恶化或新出现的疾病或病理生理状态，用其他因素无法解释的事件[11]。主要包含两个方面：（1）可能预知的IAEs。需要增加第3种升压药或升压药以下规定的增加剂量：去甲肾上腺素0.2 μg/kg.min，多巴胺10 μg/kg.min，肾上腺素0.1 μg/kg.min；血氧下降或缺氧导致需吸氧浓度上调≥ 20%，PEEP上调≥5 cmH2O才能满足血氧饱和度≥90%；新发的心律失常需要使用药物或电复律；输血相关的不良反应。（2）未能预知的IAEs。指未能预测且不能排除HUMSCs引起的不良事件。2. 次要观察指标：治疗前后氧合指数（PaO2/FiO2）、肺损伤评分[16]、肺水肿影像学评分（radiographic assessment of lung oedema，RALE）[17]、肺顺应性变化[ 潮气量/（平台压- 呼气末正压）]；治疗后血清及肺泡灌洗液炎症标记物水平；28 d死亡率、无需连续性肾脏替代治疗（continuous renal replacement therapy，CRRT）时间、无需血管活性药物时间、无器官衰竭天数、存活患者机械通气时间、ICU住院时间。六、 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。呼吸及血流动力学参数等正态分布的资料以x±s表示，非正态分布计量资料采用M（Q25，Q75）表示。治疗后呼吸及血流动力学参数变化、肝肾功能指标变化以及7 d内指标（氧合指数、肺损伤评分、RALE评分、肺顺应性）变化采用单因素重复测量方差分析，两两比较采用Bonferroni法。血清及肺泡灌洗液变化采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Dunn"s法。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果一、HUMSCs输注前呼吸生理参数及肺损伤评分按ARDS PaO2/FiO2严重程度分级，符合中度诊断标准患者6例，平均氧合指数为（128±18）mmHg，符合重度诊断标准患者4例，氧合指数为（80±15）mmHg。患者肺损伤评分为2.0～4.0分，潮气量为5.5～7.4 ml/kg，平台压为23～32 cmH2O，PEEP为8～13 cmH2O，肺顺应性为20.5～33.2 ml/cmH2O，影像学RALE评分为26～40分。二、HUMSCs输注的安全性HUMSCs输注期间或输注后6 h内，均未出现过敏、溶血、心律失常、心跳骤停等任何直接相关的IAEs。HUMSCs输注后24 h内，中度及重度ARDS患者心率、呼吸、平均动脉压及中心静脉压监测如下图所示（图1）。相较于输注前（0 h），中度及重度患者心率（F=0.79，P=0.43）、呼吸（F=0.38，P=1.47）、平均动脉压（F=0.49，P=0.52）及中心静脉（F=2.27，P=1.25）在HUMSCs输注后无明显变化（P>0.05）。此外，HUMSCs输注后28 d内，患者肝、肾功能均未出现明显异常，而血肌酐在输注后12 d较输注前明显下降（t=-3.70，P<0.007；图2）。
三、HUMSCs输注改善肺损伤患者氧合指数、肺损伤评分及RALE评分在HUMSCs输注后均有所改善。与输注前比较，患者的氧合指数在1 d迅速改善（t=3.00，P<0.017），肺损伤评分、肺部影像学RALE评分分别在3、7 d明显改善（t=-4.00，-4.40；P<0.017）。患者肺顺应性在HUMSCs输注后有一定上升，但差异无统计学意义（F=2.13，P>0.05；图3）。
四、MSCs输注后肺损伤指标改变与输注前比较，患者血清炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8、Ang-2及肺泡灌洗液炎症因子TNF-α水平有一定下降，但差异无统计学意义（H=5.14，4.05，3.76，5.00，3.42；P>0.05；图4，5）。
五、临床结局HUMSCs输注后28 d内，6例难治性中度ARDS肝移植患者，其中4例均在1周内氧合好转后顺利脱机拔管，由ICU转入普通病房。另2例疗效不佳，其中1例死于严重感染合并严重骨髓抑制、感染性休克；另外1例原发病为移植后免疫抑制状态下严重肺部感染，死于感染性休克合并呼吸、肾衰竭。4例重度难治性ARDS患者中，2例为移植术后泛耐药鲍曼不动杆菌血流感染，并感染性休克；2例为移植术后耐药洋葱伯克霍尔德氏菌及泛耐药鲍曼不动杆菌肺部感染，抗感染效果不佳，MSCs挽救性治疗未能改善预后，死于原发病进展。患者无CRRT 时间、无血管活性药物时间、无器官衰竭时间、存活患者机械通气时间以及ICU 住院时间的中位天数分别为4（1，25）、1（0，22）、0（0，8）、5（3，7）、10（6，20）d。
讨论
近年来，MSCs在多种炎性相关的损伤性疾病中被广泛研究。课题组前期在内毒素诱导的急性肺损伤动物模型研究发现，靶向荧光标记的MSCs不仅具有向损伤部位聚集的作用，且可以有效地减少急性肺损伤小鼠模型肺部炎症细胞浸润，减轻肺组织的损伤程度[15]。此外，国内外不少研究同样表明MSCs可有效地减轻肺泡损伤，促进肺损伤修复，逆转病理改变[18]。
尽管目前已有大量基础研究表明MSCs在肺损伤模型中具有良好的治疗效果，但目前有关MSCs治疗ARDS的临床研究并不多见。相对于干细胞疗法，有关ARDS干预治疗的临床研究仍多集中在肺保护性通气策略的改进及对传统治疗药物疗效的探索，不少基础研究虽然显示良好的治疗效果，但在临床试验中并未能有效地改善患者生存。如阿司匹林、他汀类的调控炎症，β2受体激动剂的促液体转运，吸入NO调控氧化应激、角化细胞生长因子（keratinocye growth factor，KGF）促上皮修复再生等治疗ARDS的临床试验[6-7，19-21]。其中原因可能为单一的治疗并不能解决ARDS多种致病机制，因此MSCs固有的调节免疫、抗氧化、促修复和再生等多种治疗机制可能对治疗ARDS具有极大的治疗价值。理论上，作为外来性异源物质，MSCs具有诱发急性免疫排斥或引起肺栓塞从而加重ARDS患者病情的可能。本研究首次探索了HUMSCs在肝移植术后ARDS患者中治疗的安全性及疗效，结果表明在所有干细胞输注患者中，均未发生如肺栓塞、恶性心律失常、呼吸或心跳骤停等HUMSCs输注相关不良事件，呼吸及血流动力学参数监测未出现明显波动，肝、肾功能在干细胞输注后28 d内均未出现明显异常，提示MSCs输注具有很好的耐受及安全性，这与国外Matthay等[22]研究结果相符。然而，在目前已有的MSCs治疗ARDS临床研究项目中，MSCs并未体现出明显的疗效。如在近期START研究中，骨髓来源的MSCs并未能明显改善ARDS 患者的主要临床结局指标与生存预后[22]。究其原因，MSCs的活力可能是影响治疗效果的主要原因。为此，本研究所用HUMSCs均由医院生物治疗中心专门制备、新鲜提供，在确保品质均一的基础上也可以很好地避免长途运输过程中对干细胞的活性造成影响。本研究表明，患者氧合指数在HUMSCs输注后1 d迅速改善，肺损伤评分及RALE评分分别在输注后3、7 d下降，因此，MSCs在改善患者氧合、减轻炎症渗出上可能具有潜在的疗效。此外，患者血清炎症因子（TNF-a、IL-6、IL-8）、内皮损伤标记物（Ang-2）及肺泡灌洗液炎症因子（TNF-a）在HUMSCs 输注后中位数呈下降趋势，提示HUMSCs可能很好地起到减少炎症因子和减轻肺泡上皮损伤的作用。在干细胞治疗中，考虑不同治疗群体的异质性是十分必要的。在ARDS发生发展过程中，多数早期轻度ARDS患者在给予常规治疗后可缓解，而重度ARDS患者又往往合并严重的多器官功能衰竭，从而影响生存率。本研究进一步探讨了HUMSCs在肝移植术后难治性ARDS患者的治疗价值，在患者行常规治疗无明显改善后予行MSCs输注治疗。此类入组患者本身往往具有较高的死亡率。例如，在Villar等[2]的多中心观察性研究中，经机械通气治疗及液体管理等治疗24 h后，ARDS未有改善，仍为中度ARDS的患者死亡率为42.8%，仍为重度ARDS死亡率为67.0%。本研究中，经机械通气及液体管理、体位治疗等措施后，仍为中度的肝移植患者死亡率为2/6，低于文献报道的难治性中度ARDS死亡率（42.8%），提示MSCs治疗在中度ARDS患者人群可能具有更好的预后。而在重度患者中，4例患者在28 d内均未能存活，需要指出，4 例均为免疫抑制合并多重耐药菌感染，其中3例为移植术后泛耐药鲍曼不动杆菌感染，1 例为耐药洋葱伯克霍尔德氏菌感染。已有研究报道，耐药菌感染本身是导致肝移植术后死亡的独立危险因素，死亡率可高达48%～82%[23-24]。因而，挽救性的HUMSCs输注治疗可能并不能有效改善肝移植术后合并耐药菌感染的重度ARDS患者生存结局。综上所述，HUMSCs治疗肝移植术后难治性ARDS患者安全可行，对肺损伤有显着改善。但HUMSCs对肝移植后ARDS患者的疗效以及预后影响还有待进一步评估。此外，MSCs治疗ARDS的受益人群、时机选择、最佳输注剂量以及输注方式等问题，也有待于后续大规模临床研究。
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