卵巢癌和三阴性乳腺癌是引起女性癌症患者死亡的两大疾病。这两种癌症具有高转移率，且其靶向治疗对策较少。我们已经知道癌细胞通过细胞表面抗吞噬信号（包括CD47、PD-L1、B2M等）的高表达能够逃脱巨噬细胞的吞噬。而单克隆抗体可以结合它们表面这种抗吞噬信号，从而避免其逃脱巨噬细胞的吞噬。在本研究中，研究人员通过肿瘤相关巨噬细胞表达的抑制性受体唾液酸结合的类胰岛素样凝集素10 (Siglec-10)与肿瘤表达的CD24相互作用，证明了肿瘤表达的CD24在促进免疫逃避方面的作用，发现CD24是治疗卵巢癌和乳腺癌细胞的细胞免疫疗法的有望靶点。研究人员发现许多肿瘤过度表达CD24，而肿瘤相关的巨噬细胞表达高水平的Siglec-10。通过单克隆抗体对CD24或Siglec-10进行基因消融，以及阻断CD24-Siglec-10相互作用，检测到所有表达CD24的人类肿瘤的吞噬能力都得到了显着增强。CD24的基因消融和治疗阻断可使得体内巨噬细胞依赖性肿瘤生长减慢，与此同时病人生存时间延长。这些数据揭示了在几种癌症中CD24是一种高表达的、抗吞噬的信号，也证明阻断CD24在癌症免疫疗法中具有治疗潜力。
CD24，又称热稳定抗原或小细胞肺癌簇4抗原，是一种高度糖基化的糖基磷脂酰肌醇锚定表面蛋白。众所周知，它与先天免疫细胞上的Siglecl-10相互作用，抑制对感染、败血症、肝损伤和慢性移植物抗宿主疾病的破坏性炎症反应。CD24与Siglecl-10的结合引发了一种抑制性信号级联，该信号级联是由Src同源区2域中含有磷酸化酶SHP-1和/或SHP-2介导的。这些磷酸酶与Siglecl-10细胞质尾部的两个基于酪氨酸的免疫受体抑制基序相关，从而阻断Toll样受体介导的炎症和巨噬细胞吞噬细胞所需的细胞骨架重排。
为了评估CD24-Siglecl-10信号在调节巨噬细胞介导的癌症免疫反应中的作用，研究人员检测了CD24和Siglecl-10在各种肿瘤及相关免疫细胞中的表达。扩展数据图1可以看到，CD24在几乎所有肿瘤中的高表达，以及与已知的先天免疫检查点相比，CD24在几种肿瘤中的表达普遍上调(图1a)。卵巢癌中CD24的上调幅度最大，增加9倍以上；此外，CD24在三阴性乳腺癌(TNBC)的表达显着高于健康的乳房细胞或雌激素和黄体素受体阳性(ER+PR+)乳腺癌(扩展数据图1b,c)。分层CD24表达显示CD24表达较低可增加无复发卵巢癌患者和乳腺癌患者的总体生存优势(图1b,c)。研究人员利用来自TNBC六个主要样本的单细胞rna测序数据在肿瘤细胞水平上研究了CD24和SIGLEC10的表达。在所有被分析的患者中CD24的表达显着高于PD-L1(又称为CD274)(扩展数据图1f)，而且CD47在所有细胞类型中均高表达(图1d)。CD24在在乳腺癌细胞和卵巢癌细胞中均有较强的表达，在其他细胞簇中表达较弱，表明CD24有作为肿瘤特异性标志物的潜力。大量肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)表达SIGLEC10，表明CD24-SIGLEC-10在TNBC中相互作用的可能性(图1d)。
Fig. 1 CD24 is overexpressed by human cancers and is co-expressed with Siglec-10 on TAMs.
Extended Data Fig. 1 Expression of innate immune checkpoints in human cancer.
为了研究CD24-Siglecl-10信号在调节巨噬细胞介导的抗肿瘤免疫反应中的作用(图2a)，研究人员设计了CD24正常阳性的MCF-7人乳腺癌细胞系CD24缺失(△CD24)的多克隆亚基。无论是野生型还是△CD24细胞与表达Siglecl-10的M2样巨噬细胞共培养表明，CD24基因缺失足以增强吞噬作用(图2b)。CD24细胞对CD47阻断的敏感性也明显高于野生型细胞，说明CD24与CD47阻断具有协同性。用pH敏感染料pHrodo Red标记GFP+野生型和△CD24细胞与巨噬细胞共培养36h，发现与野生型细胞相比，△CD24细胞在低pH吞噬溶酶体中更容易被吞噬和降解(图2c)。
Fig.2 CD24 directly protects cancer cells from phagocytosis by nacrophages.
单克隆抗体阻断Siglecl-10增强了巨噬细胞的吞噬能力，从而证实了Siglecl-10在抑制吞噬中的作用(图2d)。为了进一步研究SIGLEC10表达对吞噬作用的影响，研究人员在供体来源的巨噬细胞中敲除了SIGLEC10基因。用针对SIGLEC10位点的单导RNA电穿孔3天后，观察到SIGLEC10的表达明显低于单独用Cas9电穿孔的细胞(Cas9对照)(图2e)。SIGLEC10敲除巨噬细胞的吞噬能力明显强于Cas9对照组巨噬细胞(图2f)。
据报道，Siglecl-10与高度唾液酸化的CD24相互作用。因此，本研究观察到Siglecl-10-Fc与表面去唾液酸的MCF-7细胞的结合显着减少(图2g，扩展数据图3b)。这一结果表明，Siglecl-10具有识别蛋白质和唾液酸配体的能力，可能具有除CD24之外的不同配体。事实上，仅CD24的缺失不足以完全消除表面唾液酸化存在下的Siglecl-10-Fc结合(扩展数据图3a,b)。然而，在缺乏表面唾液酸化情况下，CD24的缺失几乎破坏了Siglecl-10-Fc结合，说明CD24是Siglecl-10的主要蛋白配体(图2h,扩展数据图3b)。
Extended Data Fig. 3 Siglec-10 binds to CD24 expressed on MCF-7 cells.
为了研究这些发现对人类癌症的治疗潜力，研究人员通过干扰CD24-Siglecl-10信号通路，研究了单克隆抗体(mAb) 直接阻断CD24是否能增强CD24+肿瘤的吞噬作用(扩展数据图4a)。研究发现经过CD24阻断mAb(克隆SN3)处理的MCF-7 pHRodo Red+细胞更容易被低pH的吞噬溶酶体吞噬(图2i，扩展数据图4b)。抗CD24单克隆抗体治疗后，观察到大量的全细胞吞噬，CD24和CD47双重阻断进一步增强了细胞吞噬(扩展数据图4c,d)。同样，基于流式细胞术的测量结果显示，与IgG对照组相比，加入抗CD24单克隆抗体后，吞噬作用显着增加，这要大于CD47抑制剂的作用(图3a)。抗CD24单克隆抗体的反应呈剂量依赖性和饱和性(扩展数据图5b)。CD24阻断增强了所有CD24表达的被测癌细胞系的吞噬作用，包括乳腺癌(MCF-7)、胰腺癌(Panc1)、胰腺神经内分泌肿瘤(APL1)和小细胞肺癌(NCI-H82)，对CD24-细胞(U-87 MG)无明显作用(图3b，扩展数据图5c)。在CD24和CD47阻断抗体的双重治疗下，某些癌症的吞噬能力提高到基线水平的近30倍。虽然CD47基因的缺失并没有改变MCF-7细胞的吞噬敏感性，但在抗CD24单抗治疗后，△CD47细胞比野生型细胞更容易被吞噬(扩展数据图5d)。抗CD24单克隆抗体和西妥昔单抗对胰腺癌细胞的联合治疗增强了吞噬作用，证明了抗CD24单克隆抗体和抗实体瘤单克隆抗体之间的潜在协同作用(扩展数据图5e)。SIGLEC10基因缺失导致CD24阻断反应显着降低，这表明抗CD24单克隆抗体特异性干扰CD24-Siglecl-10信号通路(图3c)。CD24的表达与CD24封锁以及基线吞噬作用水平相关，表明CD24的组织特异性表达是一种显性的“don"t eat me”信号，其潜在价值是先天抗肿瘤免疫反应的预测因子(图3d，扩展数据图6f)。
Fig. 3 Treatment with anti-CD24 mAb promotes phagocytic clearance of human cancer cells.
Extended Data Fig. 4 Anti-CD24 monoclonal antibodies promote phagocytic clearance of cancer cells over time.
Extended Data Fig. 5 CD24 antibody blockade of CD24-Siglec-10 signalling promotes dose-responsive enhancement of phagocytosis.
Extended Data Fig. 6 The opsonization effect of anti-CD24 mAb is minor and CD24 blockade promotes phagocytosis of primary TNBC.
研究人员收集了转移性卵巢癌患者的卵巢癌细胞，用抗CD24单克隆抗体治疗来确定原发肿瘤的吞噬能力(图3e)。在这些病例中，CD24阻断的效果明显大于CD47, CD24和CD47抗体阻断的双重治疗增加了吞噬作用(图3f)。此外，抗CD24单抗治疗原发性TNBC细胞可促进巨噬细胞吞噬，而CD47阻断对吞噬作用没有影响；这表明抗CD24单抗可能对CD47阻断有耐药性的癌症有效(扩展数据图6g)。
Extended Data Fig. 7 Gating strategy for in vivo phagocytosis.
为了研究CD24诱导的吞噬抑制作用是否能在体内重现，将GFP-荧光素酶+ MCF-7野生型或MCF-7(△CD24)细胞植入NOD。移植三周后，研究发现与野生型肿瘤相比，浸润TAMs的CD24缺陷肿瘤吞噬作用增强，同时也具有更多的炎症表型(扩展数据图7,8a, b)。几周后观察到△CD24肿瘤的生长明显低于野生型(图4a, b)。经过35天的生长，多克隆的△CD24肿瘤大部分变成CD24+，这与TAMs对CD24-细胞的选择以及没有双等位基因CD24缺失的CD24+细胞亚克隆的出现相一致(扩展数据图8d, e)。TAMs的丢失在很大程度上抵消了△CD24肿瘤中观察到的肿瘤减少，这表明TAM介导的△CD24细胞清除的增加是肿瘤负荷减少的原因(图4b，扩展数据图8f)。这种肿瘤生长的减少归因于吞噬能力的增强，这使得移植了CD24缺陷肿瘤的小鼠具有显着的生存优势。
Fig. 4 CD24 protects cancer cells from macrophage attack in vivo.
Extended Data Fig. 8 Characterization of MCF-7 wild-type and MCF-7(△CD24) cells in vitro and in vivo.
为了证明CD24治疗阻断可以调节抗肿瘤免疫增强，将MCF-7野生型肿瘤的NSG小鼠用抗CD24单克隆抗体治疗2周。与IgG治疗组相比，抗CD24治疗显着降低了肿瘤的生长(图4d, e，扩展数据图9d)。
Extended Data Fig. 9 Validation of CD24 inhibition in in vivo models of ovarian and breast cancer.
人类抗CD24单抗治疗的潜在靶外效应包括B细胞的耗竭，这是由于B细胞高表达CD24所致。事实上，抗CD24单抗治疗后，可观察到健康B细胞的吞噬清除(扩展数据图10a)。
Extended Data Fig.10 Anti-CD24 mAb induces B cell clearance but does not bind human red blood cells, and CD47 and CD24 demonstrate inversely correlated expression in human diffuse large B-cell lymphoma.
CD24是一种有效的抗吞噬信号，“don"t eat me”能够直接保护癌细胞免受表达Siglecl-10的巨噬细胞的攻击。通过单克隆抗体阻断CD24-Siglecl-10信号能显着提高CD24+肿瘤的清除率，表明CD24阻断有望用于免疫治疗。卵巢癌和乳腺癌对抗PD-L1/PD-1免疫治疗的反应都比其他癌症弱，因此需要另一种策略来实现对多种癌症的治疗。值得注意的是，“don"t eat me”信号CD47、PD-L1、B2M和现在的CD24都涉及巨噬细胞信号，这些信号基于免疫受体酪氨酸为基础的抑制基序。这可能表明巨噬细胞耐药癌细胞亚群的免疫抑制是一种保守机制，从而导致肿瘤从本质上避免巨噬细胞的监视和清除。CD24的高表达可能抑制对依赖巨噬细胞功能的治疗的反应，因此CD24的表达可直接预测肿瘤对现有免疫治疗的反应性。CD24和CD47在弥漫性大B细胞淋巴细胞瘤患者中的表达呈负相关(扩展数据图10c)。CD24过表达患者的比例与抗CD47+利妥昔单抗联合治疗本病的反应率比较良好，这为特定肿瘤对抗CD24和/或抗CD47单克隆抗体治疗可能产生不同反应提供了可能性。确定癌症和相关巨噬细胞表达的促吞噬和抗吞噬信号的集体表达，可以更好地预测哪些患者可能对治疗产生反应。本研究将CD24-Siglecl-10定义为一种天然免疫检查点，是介导抗肿瘤免疫的关键，并为治疗提供了依据CD24具有潜在的抑制作用，尤其有望用于治疗卵巢癌和乳腺癌。
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