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TNB检测
即便同一肿瘤的基因突变也存在广泛的不同，因此我们可以说，肿瘤新生抗原相关的免疫疗法是一种真正的个体化治疗。制定肿瘤个性化免疫疗法的第一步就是鉴定并选择患者特异性的新生抗原。
APCs：抗原递呈细胞，HLA:人白细胞抗原，PBMCs：外周血单核细胞，TMG:串联微基因，WES:全外显子组测序
如上图所示，目前有三种新生抗原鉴定方法：
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用WES确定肿瘤特异性突变，RNA测序确认，通过预测突变形成的多肽与自身HLA的亲和力高低来进行评分，最后根据分值高低选出突变合成新肽并通过体外T细胞反应性分析确定其免疫原性。
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用WES确定肿瘤特异性突变，以TMG载体为模板合成IVT RNA，然后进行体外T细胞反应性分析，确定其免疫原性。
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基于数据库和文献的研究鉴定突变，接下来的步骤可以与上面描述的两种方法中的任意一种相同。
到目前为止，用于鉴定T细胞新表位的最有用的工具是设计用于预测肽段-HLA结合亲和力的算法。即通过WES测序确定HLA分型，鉴定肿瘤特异性突变，通过RNA测序确认突变基因是否表达，根据预测到的突变后的多肽与自体HLA亲和力高低进行分级，基于高质量的基因突变合成新肽，进行离体T细胞反应性分析确认它们的免疫原性。此外，基因表达水平/蛋白质翻译水平也可能被用来帮助预测表位丰度。具体流程如下：
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采样：获取肿瘤组织和正常细胞；
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测序：用WES对肿瘤组织和正常组织进行基因突变的检测；
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分型：检测患者HLA分型，观察HLA是否具有多样性；检测患者HLA是否发生杂合性缺失；
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选取肽段：在WES检测到的变异位点上下游区域找出产生长度为8-11的突变肽段（HLA-I型结合的肽段长度一般为8-11）；
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表达：筛选出在RNA水平上有检测到表达的突变肽段；
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亲和力预测：利用NetMHCpan等软件预测每条突变肽段以及相应野生型肽段与HLA的亲和力（锚定残基位置）；
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过滤：基于预测的突变肽段-HLA以及正常肽段-HLA亲和力过滤；
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验证：对筛选出的新生抗原进行免疫原性检测并进行选择。
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新生抗原应用
特异性新生抗原的应用方案
如上图所示，常见新生抗原的应用有：
①免疫治疗结合放疗等干预措施，并诱导自体新生抗原的暴露。
② 制作个体化疫苗，与免疫检查点抑制剂联用。（个体化疫苗是指利用已鉴定出的新生抗原，在体外合成相对应的抗原肽、核酸等，以不同形式导入患者体内，通过刺激体内T细胞，激发特异性细胞免疫，达到杀伤肿瘤细胞的目的。疫苗可以同时靶向多个肿瘤新生抗原，增加产生有效抗肿瘤应答的概率，个体化程度高，安全性好。）
③ 体外诱导或扩增对新生抗原敏感的T细胞，将免疫细胞疗法和免疫检查点抑制剂联用。
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TNB检测的阻碍
1.原始样本存在误差
① 鉴定肿瘤突变基因依赖于基因测序，但基因测序技术可能带来额外的基因突变。
② 目前主流的二代基因测序技术仅对单核苷酸突变的测定结果较为准确，不能预测由长插入和/或缺失突变、剪接位点突变、基因融合、表观遗传改变和翻译后修饰（例如磷酸化或去糖基化）引起的某些新生抗原。
③ 肿瘤存在异质性。不同肿瘤、患者、病灶间存在异质性；同一个部位的肿瘤其内部的基因突变状况依然存在时间和空间上的差异。基因测序所使用的肿瘤样本通常是肿瘤中的一部分，很难代表个体的基因突变状况。
2.预测准确性不足
目前研发的算法存在不足：
① 只能预测部分HLA-I类抗原，HLA-II类抗原的预测困难。（HLA-II分子可容纳11-20的肽段，且HLA-II结合的亲和力受肽核心和肽侧翼残基的影响，难以预测。）
② HLA分子存在多样性和群体差异，各数据库容量不足，仅有部分HLA等位基因的亲和力数据。
③ 通过算法预测肿瘤新抗原难以达到较高的准确性，容易出现TNB被高估的情况。（据统计数据显示，公开的NetMHCpan/NetMHC算法预测出的新抗原只有少于5%的会表达在肿瘤细胞表面；只有1%的会与HLA结合而被递呈。）
④ 无法考虑影响免疫原性的每个因素，例如蛋白酶体的肽加工、MHC结合稳定性、遗传插入缺失或融合等等。
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提升TNB鉴定准确度
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由于TNB的形成过程复杂，应通过表达、克隆、HLA的亲和力、TCR的亲和力等综合筛选高质量的新生抗原。
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提高HLA基因型检测的准确性，开发新的算法预测HLA-II型类新生抗原。
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预测翻译错误引起的基因融合或病毒整合来源的新生抗原。
根据以往的研究,肿瘤免疫治疗的成功离不开新生抗原和特异性T细胞。总的来说,导致肿瘤生长的基因突变也可以被免疫系统识别并作为攻击恶性肿瘤的手段。基于这一重要发现,设计干预手段来选择性地增强新生抗原和T细胞间的反应活性是必要的，因此高质量新生抗原的筛选也是免疫治疗中必不可少的。肿瘤新生抗原的发现,为这些个性化的肿瘤免疫疗法提供了高特异性和安全性的方案，也为众多肿瘤患者提供了新的希望,这将进一步提高人类战胜恶性肿瘤的信心和决心。
参考文献：
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