结核分枝杆菌(TB)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒
【生产厂家】深圳市匹基生物工程有限公司
【批准文号】国药准字S0084
【剂 型】检测试剂盒
【规 格】48人份
【医保类型】
【国家基本药物】否
【正文】
结核分枝杆菌（TB）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒说明书-深圳市匹基生物工程股份有限公司
结核分枝杆菌（TB）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒说明书
Operation Introduction for Mycobacterium tuberculosis (TB) PCR Fluorescence Diagnostic Kit
前言
本试剂盒采用一对PCR引物和一个荧光双标记的探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，从而将PCR技术和荧光检测技术结合起来，实现了对TB核酸的自动化检测。检测灵敏度为10个TB菌/毫升。试剂盒在PCR循环结束后无需开盖。试剂盒中采用了dUTP-UNG酶防污染系统。
本品可用于可疑结核病患者经处理的痰液标本结核分枝杆菌核酸的定性检测，可用于结核病的辅助诊断。
试剂盒组成
组成成份（48tests/kit） 规格
样本处理试剂
DNA提取液 1ml×2管
核酸扩增试剂
TB PCR反应液（PE5700/PE-7700/Bio-Rad iCycler用） 1ml×2管
或TB PCR反应液（Roche LightCycler用） 1ml×1管
Taq酶 (5U/ul) 10ul×1管
UNG（1U/ul） 5ul×1管
对照品
阴性对照 1ml×1管
强阳性对照1ml×1管
临界阳性对照 1ml×1管
贮存条件及有效期
本试剂盒贮存于-20℃的条件下有效期为一年（请于有效期内使用）。
自备试剂
4％NaOH、灭菌生理盐水
样本采集、存放及运输
1．采集：
以清晨第一口痰为宜。先用清水漱口，嘱患者用力咳出深部的痰于无菌样本保存管，密封，即可送检。
2．存放：
待测样本在2-8℃保存不应超过24小时；-20℃保存不超过三个月； -70℃以下长期保存。应避免反复冻融。
3．运输：
采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
适用仪器
1．BIO-RAD iCycler荧光PCR检测仪、PE Gene Amp 7700荧光PCR检测仪
2．Roche LightCycler荧光PCR检测仪
3．其它荧光PCR检测仪，如PE-5700、PE-7000、基因公司Rotor-Gene、MJ公司Opticon Monitor、大和Line-Gene荧光定量PCR检测仪等
使用方法
1．样本处理（样本处理区）
1.1.首先对痰液样本进行目测，若样本中唾液占绝大部分，则需重新采集样本。
1.2.目测合格后，在样本中加入2～3倍体积4%的NaOH溶液，置于摇床上，在150rpm、37℃条件下处理30min或常温下1Hr，使其充分液化（无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加入少量4%的NaOH溶液直至液化完全）。
1.3.取液化后的样本900ul以及试剂盒中的阴性对照、强阳性对照和临阳性对照各500ul于1.5ml无菌离心管中，13,000rpm离心10min。
1.4.弃上清（先倒出大部分液体，再用移液器尽量吸干至无明显液滴为止），沉淀中加入1ml灭菌生理盐水，振荡悬浮（注意：按紧离心管盖后，横向按在旋涡振荡器上将沉淀振起），13,000rpm离心10min。
1.5.弃上清，用1ml灭菌生理盐水洗涤沉淀，13,000rpm离心10min。
1.6.弃上清，向沉淀中加入DNA提取液30ul，振荡混匀，2,000rpm离心5sec，放37℃温浴30min，再放入100℃水浴/干浴10min，13,000rpm离心10min，保留上清备用。（如果样本裂解产物当天不使用，请于-20℃保存。）
2.扩增试剂准备（PCR前准备区）
从试剂盒中取出TB PCR反应液、Taq酶及UNG，室温融化并振荡混匀后，2,000rpm离心10sec。
设所需要的PCR反应管管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管临界阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：
反应体系 荧光PCR检测仪 TB PCR反应液 Taq酶UNG
PE Gene Amp 7700
40ul PE Gene Amp 5700 37.8ul 0.2ul0.06ul
BIO-RAD iCycler
其它荧光PCR检测仪
20ul Roche LightCycler17.8ul 0.2ul0.03ul
Rotorgene 2000
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，充分混合均匀，2,000rpm离心10sec，向设定的n个PCR反应管中分别加入相应体积的反应液（40ul体系加入38ul，20ul体系加入18ul），转移至样本处理区。
3.加样（样本处理区）
若样本裂解产物保存在-20℃,置室温解冻后13000rpm离心5min。
向所设定的n个反应管中分别加入步骤1中处理过的样本、阴性对照、强阳性对照和临界阳性对照上清液各2ul，盖紧PCR反应管管盖【使用Roche毛细管时，将毛细管连同Roche专用金属反应管套放在离心机中，于2000rpm离心10sec】，转移至检测区。将反应管排好置于荧光PCR检测仪上，记录样本摆放顺序。
4．PCR扩增（检测区）
4.1.循环条件设置
使用PE Gene Amp 7700/5700/7000荧光PCR检测仪时循环程序设置如下：
37℃：5min；94℃：1min；
95℃：5sec，60℃：30sec，40个循环。反应体系为40ul。
使用Bio-Rad iCycler荧光PCR检测仪时循环程序设置如下：
37℃：5min；94℃：1min；
95℃：5sec，60℃：30sec，42个循环。反应体系为40ul。
使用Roche LightCycler荧光PCR检测仪时循环程序设置如下:
37℃：3min；93℃：1min；
93℃：5sec，60℃：40sec，40个循环。反应体系为20ul。
循环程序设置均应在扩增开始前样本设定时，将待检样本和对照品设定为“UNKN”。
4.2.仪器检测通道选择
PE7700和iCycler属多荧光检测仪，荧光信号收集时设定为Fam荧光素。
荧光信号收集设在60℃。
Roche LightCycler荧光PCR检测仪，仪器通道选择F1通道。荧光信号收集设在60℃，收集方式设为SINGLE。
其它类荧光PCR检测仪的具体循环程序设置方法请参照以上设置方法以及各类仪器使用说明书和实际情况而适当调整。
结果分析条件设定
1．使用PE Gene Amp 5700/7000荧光PCR检测仪进行结果分析时基线（baseline）的确定：取6—10或6—15个循环的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=40.0为准。
2．使用PE Gene Amp 7700荧光PCR检测仪进行结果分析时基线（baseline）的确定：取3—10或3—15个循环的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=40.0为准。
3．使用BIO-RAD iCycler进行结果分析时，基线（baseline）取为2—10或2—15个循环的荧光信号，阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=0.0为准。也可根据仪器噪音情况在15.0—40.0之间调整。
（在使用以上荧光检测仪进行分析的过程中，为避免漏检强阳性样本，应首先将基线定为6—10/3—10/2—10个循环的荧光信号观察分析Ct值，如果没有Ct值＜16.0的样本，则将基线改定为6—15/3—15/2—15个循环的荧光信号进行结果分析；如有Ct值＜16.0的样本，则应将该样本剔除此次结果分析，同时仍将基线改定为6—15/3—15/2—15个循环的荧光信号进行结果分析。)
4．使用Roche LightCycler荧光PCR检测仪进行结果分析时，读取F1通道的检测结果。阈值设定原则以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线无规则的噪音线的最高点，且Ct值不出现任何数值为准（一般基线定在0.001—0.05范围内，也可根据仪器本身的实际情况加以调整）。
5．其它类荧光PCR仪的结果分析方法参照以上基线及阈值设定原则以及仪器的使用说明书和实际情况而适当调整。
本试剂盒质控标准
1．阴性对照的Ct值均应等于40.0(PE5700/7700/7000)或0.0(BIO-RAD iCycler)）或无数值（ROCHE LightCycler）。
2．强阳性对照的Ct值应＜25.0。
3．临界阳性对照的Ct值应＜35.0，且临界阳性对照的Ct值应大于强阳性对照的Ct值。
否则，此次实验视为无效。
结果判断
1．检测样本Ct值为40（PE-7700/PE-5700/PE-7000）、0（BIO-RAD iCycler）和无数值（Roche LightCycler）时，报告为阴性。
2．检测样本Ct值≤37.0时，报告为阳性。
3．检测样本Ct值大于37.0的样本建议复检。复检结果Ct值＜40【iCycler上Ct值＝0及LightCycler上Ct值＝无数值均不属此范围】者均报告为阳性，否则报告为阴性。
试剂盒使用注意事项
1．本试剂盒仅用于体外检测。
2．使用前请仔细阅读本说明书。
3．实验请严格分区操作：
第一区：PCR前准备区—准备扩增所需试剂；
第二区：样本处理区—待测样本和对照品处理；
第三区：检测区—PCR扩增检测。
4．各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染，实验后即请清洁工作台。
5．试剂盒内各试剂使用前，充分融化后请稍事离心。
6．在－20℃保存的样本裂解产物，应在加样前置室温解冻，作短暂离心后使用。
7．分装有反应液的反应管应扣盖或装入密实袋内再转移至样本区。
8．加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。
9．扩增完毕立即取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。
10．反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。
11．实验中用过的吸头请直接打入盛有1%次氯酸钠的废物缸内，与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。
12．工作台及各物品定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒。
13．建议使用离心管和吸头一览表
名称 规格 生产厂家 Cat. No.
吸头 10ulTF-300
200ulTF-200
1000ul 美国AXYGEN公司 TF-1000
离心管0.5mlMCT-060-C
1.5mlMCT-150-C
14．各区域内必备物品一览表
PCR前准备区样本处理区 检测区
1．离心机1．台式高速离心机 1．荧光PCR检测仪
2．混匀器2．混匀器 2．紫外灯
3
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