(一)技术领域
本发明涉及一种整合素αvβ3靶向的aie荧光化合物，及其制备方法与应用。
(二)
背景技术：
一直以来肿瘤细胞的标记和成像被应用于癌症的诊断和临床治疗，这促进了癌细胞标记探针的开发。而标记的效果取决于靶向分子对癌细胞表达标志物的亲和力，以及荧光分子的生物相容性和荧光特性。
整合素αvβ3作为介导细胞内外环境的跨膜受体，是一种独特的分子靶点，用于早期检测和治疗快速生长的实体瘤。rgd(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽序列可以模仿细胞粘附蛋白并与整合素结合，其系列的cyclo(rgdfk)是目前αvβ3整合素的有效选择性抑制剂。在这基础上，很多的肿瘤靶向药物和标记探针已经被开发出来，包括c(rgdfk)与香豆素、bodipy、花菁等传统染料，甚至与纳米材料的结合。但是这些探针都存在着荧光染料在生物溶液中带来的高背景问题，很难将非特异性的探针荧光发射和目标靶区的荧光发射区分开来，给探针精确度带来了不好的影响。另外传统荧光分子在生物靶向聚集的过程中会产生荧光猝灭现象(acq)，使探针灵敏度降低。聚集诱导发光(aie)分子则很好的解决了这种困扰，其发光机制依靠聚集体中分子内旋转(rir)被限制，荧光强度随这分子聚集被开启和增强，在稀溶液中几乎不发光，这种低背景和高灵敏度的优势使它普遍应用于癌症识别、细胞器成像和生物大分子成像。
(三)
技术实现要素：
本发明将aie荧光分子嵌合在c(rgdfk)中，构建了一种具有aie荧光性质的靶向肽c(rgd(f-tpe)k)，目的是提供一种新的整合素αvβ3靶向的aie荧光探针，及其制备方法与应用。
本发明采用的技术方案是：
一种整合素αvβ3靶向的环肽荧光化合物，其结构如式(viii)所示：
所述c(rgd(f-tpe)k)(viii)具有aie发光特性，在溶解性强的溶剂中无荧光；在溶解性较差的溶液中，随着浓度的增高，分子内旋转(rir)被限制而产生荧光，最大发射波长为460nm。进一步具有特异性靶向整合素αvβ3蛋白高表达的癌细胞的能力。
本发明还涉及制备所述的荧光化合物的方法，所述方法包括：
(1)化合物(ii)与联硼酸频那醇脂在dmf溶剂中，70～80℃和氮气保护条件下，以pdcl2(dppf)为催化剂，在koac存在下进行suzuki反应，反应结束后分离纯化得到化合物(iii)；
(2)化合物(iii)与三苯基溴乙烯在thf和h2o混合溶剂中，70～80℃和氮气保护条件下，以pd(pph3)4为催化剂，在k2co3存在下进行suzuki反应，反应结束后分离纯化得到化合物(iv)；
(3)化合物(iv)使用hcl-1,4二氧六环脱去boc保护基得到化合物(i)；
(4)式(i)所示的aie苯丙氨酸在50℃条件，diea存在下，在dmf溶剂中用fmoc-osu保护氨基得到化合物(v)。其它保护氨基酸为：fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-lys(boc)-oh。
(5)化合物(v)采用ctc树脂固相合成式(vi)所示五肽链。式(v)所示作为特殊氨基酸，置于直链肽中端。氨基酸c端到n端延伸顺序为：fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、化合物(v)、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-gly-oh；
(6)化合物(vi)用3％tfa的dcm溶液切离树脂后，在hobt、edc、diea存在下进行缩合环化，常温反应时间2小时，反应完全后分离纯化得到化合物(vii)。
(7)化合物(vii)使用95％tfa脱去氨基酸所有保护基，得到所述荧光化合物(viii)；
步骤(2)中，化合物(ii)、联硼酸频那醇脂、pdcl2(dppf)和koac的物质的量之比优选为1:1.5:0.06:2.8。具体的，步骤(2)中分离纯化方法为柱层析，以二氯甲烷：甲体积比30:1混合液为洗脱剂，收集目标组分，干燥，获得所述式(iii)化合物。
步骤(3)中，化合物(iii)、三苯基溴乙烯、pd(pph3)4、k2co3的物质的量之优选为1:1.2:0.05:3；溶剂中thf:h2o体积比为10:1。具体的，步骤(3)中分离纯化方法为柱层析，以二氯甲烷：甲体积比15:1混合液为洗脱剂，收集目标组分，干燥，获得所述式(iv)化合物。
步骤(4)中，化合物(i)：fmoc-osu：diea物质的量之比为1:1.5:3。
步骤(5)中，氨基酸缩合条件为：树脂：氨基酸：hbtu:diea＝1:3:3:3。fmoc保护基以20％哌碇dmf的溶液脱除。
步骤(6)中化合物(vi)：hobt：edc：diea物质的量之比为1:2:2:3。具体的，步骤(6)中分离方法使用薄层层析,流动相为二氯甲烷：甲醇＝24:1，产物rf值为0.4-0.6。
本发明还涉及所述荧光化合物作为荧光探针在细胞荧光共聚焦成像中的应用，具体的，所述荧光探针靶向整合素αvβ3高表达的癌细胞。
优选的，所述癌细胞为a549细胞。
本发明的有益效果主要体现在：本发明合成了一种新的具有aie发光功能的靶向肽c(rgdf-tpek)，实现了在不破坏靶向结构和功能的前提下，整合素αvβ3的aie荧光探针的构建。相比现有将荧光分子和靶向肽相连的策略，本发明将aie分子嵌合于整合素αvβ3靶向肽c(rgdfk)的结构中，可以在整合素αvβ3高表达的肿瘤细胞表面发生聚集，分子内旋转受限(rir)而产生aie发光，具有发光强度高，背景低和灵敏度高的特性。
(四)附图说明
图1为化合物(iii)的核磁氢谱图。
图2为化合物(iv)的核磁氢谱图。
图3为化合物(i)的核磁氢谱图。
图4为化合物(i)的核磁碳谱图。
图5为化合物(v)的核磁氢谱图。
图6为化合物(vi)的lc-ms图。
图7为化合物(vii)的lc-ms图。
图8为化合物(viii)的lc-ms图。
图9为化合物(viii)浓度为40μm时，在二甲亚砜和pbs溶液中的荧光光谱图。
图10为在pbs溶液中(1％dmso)，不同浓度化合物(viii)的荧光光谱图。
图11为化合物(viii)在a549细胞中孵育30min后的荧光共聚焦成像图。
图12为化合物(viii)在hek-293细胞中孵育30min后的荧光共聚焦成像图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：化合物(viii)的合成
(1)化合物ii2.0g(5.12mmol)溶于3ml无水dmf中，加入联硼酸频那醇脂1.9g(7.67mmol)，pdcl2(dppf)224.3mg(0.306mmol)，醋酸钾1.4g(14.3mmol)，在氮气保护，80℃条件下反应12小时。tlc点板反应完全(tfa熏后茚三酮显色)，分别加入50ml的二氯甲烷和水，萃取2遍收集有机相。饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后，减压旋蒸去除溶剂，取浓缩物进行硅胶柱分离(二氯甲烷：甲醇＝30:1，v/v)，得到无色油状物化合物iii1.82g，产率91％。化合物iii核磁氢谱图见图1，(1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.77(d,j＝7.8hz,2h),7.21(d,j＝7.5hz,2h),4.94(d,j＝7.0hz,1h),4.61(d,j＝5.5hz,1h),4.14(q,j＝7.1hz,1h),3.18(ddd,j＝51.3,13.9,5.6hz,2h),1.35(s,12h),1.32–1.20(m,9h).
(2)化合物(iii)准确称取939mg(2.4mmol)，加入三苯基溴乙烯670.4mg(2mmol)，pd(pph3)4115.55mg(0.1mmol),碳酸钾828mg(6mmol)，溶于3ml四氢呋喃溶液中，并加入300μlddh2o。在80℃氮气保护条件下反应8小时。tlc监测反应完全后，加入等体积的乙酸乙酯和水，萃取收集有机相层，饱和氯化钠水洗并用无水硫酸钠干燥。减压旋蒸去除溶剂，取浓缩物进行硅胶柱分离(二氯甲烷：甲醇＝15:1，v/v)，收集得到1.18g黄色油状物，即为化合物iv，产率95％。化合物iv核磁氢谱图见图2，(1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.11–7.06(m,3h),7.06–6.94(m,12h),6.88(s,4h),4.17(s,1h),2.87(d,j＝210.4hz,2h),1.30–1.24(m,9h)。
(3)1.18g化合物iv加入20mlhcl-二氧六环溶液，常温搅拌1h，减压浓缩后加入乙醚，抽滤得到白色固体化合物(i)。化合物(i)核磁氢谱图见图3，1hnmr(500mhz,dmso)δ8.48(s,2h),7.17–7.07(m,9h),7.06(d,j＝8.1hz,2h),7.01–6.94(m,6h),6.92(d,j＝8.2hz,2h),4.06(t,j＝6.4hz,1h),3.09–2.98(m,2h)。化合物(i)核磁碳谱见图4。
(4)准确称取化合物(i)1.0g(2.39mmol)，fmoc-osu1.2g(3.58mmol)溶解在30mldmf溶液中,加入1.2mldiea，40℃下反应4小时。tlc监测反应完全后，加入二氯甲烷和水，萃取收集有机相层。减压旋蒸去除溶剂，取浓缩物进行硅胶柱分离(二氯甲烷：甲醇＝20:1，v/v)，收集得到白色固体化合物1.58g，即为化合物v。化合物v核磁氢谱图见图5，hnmr(500mhz,dmso)δ7.93–7.82(m,2h),7.62(dd,j＝6.7,3.3hz,2h),7.44–7.33(m,2h),7.30–7.21(m,2h),7.12–7.00(m,9h),6.92(dd,j＝19.3,7.3hz,8h),6.77(d,j＝7.8hz,2h),4.26(dd,j＝9.6,7.0hz,1h),4.10(dt,j＝17.6,7.4hz,2h),3.94(s,1h),3.02(d,j＝11.3hz,1h),2.82–2.71(m,1h).
(5)化合物(vi)的合成使用多肽的固相合成方法：在固相合成装置中加入fmoc-arg(pbf)-oh389.3mg(0.6mmol),ctc树脂200mg(0.6mmol)，3ml二氯甲烷溶解，并加入130μldiea(0.8mmol)，反应40min后抽去反应液。dmf洗涤3次，甲醇洗涤2次。加入20％哌啶的dmf溶液脱去fmoc保护，20min后抽去反应液，dmf洗涤3次。加入fmoc-lys(boc)-oh468.5mg(0.6mmol),hbtu380mg(0.6mmol),diea99μl(0.6mmol)反应30mim～40min。氨基检测试剂检测反应完全后抽去反应液。加入20％哌啶的dmf溶液脱保护20min，dmf洗涤次。再以同样的方法和物质的量，按照fmoc-lys(boc)-oh、化合物(v)、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-gly-oh的顺序延伸肽链。完成后加入10ml2tfa的二氯甲烷溶液，反应10min后收集滤液，调ph至中性后加入二氯甲烷萃取收集有机相，减压旋蒸去除溶剂，得到白色固体化合物(vi)252.6mg。化合物(vi)lc-ms图谱见图6，c69h89n9o13s[m+h]1284.63,found1284.75.
(6)所得化合物(vi)溶于25ml二氯甲烷中，加入hobt54.05mg(0.4mmol)，edc76.68mg(0.4mmol),并加入100μldiea(0.6mmol),30℃反应2h。监测反应完全后分别加入1nhcl，饱和nahco3洗涤，干燥后去除溶剂。使用薄层层析板分离，流动相为二氯甲烷：甲醇＝24:1，收集rf值为0.4-0.6的洗脱液得到化合物(vii)。化合物(vii)lc-ms图谱见图7，c69h87n9o12s[m+h]1267.62,found1267.49.
(7)所得化合物(vii)加入95％tfa和5％ddh2o的溶液，反应2h脱去所有保护基团，倒入冰乙醚中析出白色固体(viii)。化合物(viii)lc-ms图谱见图8，c47h55n9o7[m+h]858.42,found858.93.
实施例2：化合物(viii)的荧光性能检测
(1)不同溶剂中荧光性能检测：
移液枪吸取10μl的化合物(viii)dmso母液(4mm)分别加入到990μlpbs溶液(ph7.2，50mmol/l)和990μldmso溶液中，探针浓度均为40μm。使用酶标仪，37℃下分别测定其荧光值，激发波长为340nm，发射波长为460nm，荧光谱图见图9。
实验证明，化合物(viii)(40μm)在溶解性好的dmso溶液中荧光强度大大低于在溶解性较差的pbs溶液，由溶解性导致的aie荧光特征明显。
(2)不同浓度下荧光性能检测：
移液枪吸取10μl的化合物(viii)dmso溶液(8mm)加入到990μlpbs溶液(ph7.2，50mmol/l)中，化合物(i)浓度为80μm，依次稀释为不同浓度(2μm、5μm、10μm、50μm、80μm)，37℃、340nm激发下测定其荧光值。发射波长为460nm，荧光谱图见图10。
实验证明，在pbs溶液中，发射波长为460nm的条件下，随着荧光化合物(viii)随着浓度逐渐升高，荧光差异变化明显，80μm浓度的荧光强度超过了2μm荧光强度的100倍，表现出aie灵敏的荧光响应以及低荧光背景值。
实施例3：化合物(viii)的靶向功能研究
a549和hek293细胞以接近3×105个细胞分别接种培养在2个共聚焦盘中，由dmem培养液在37℃、5％co2条件下进行恒温培养，培养24小时后，移除dmem培养液，pbs7.2缓冲液洗涤3次。分别加入配好的5μm浓度化合物(viii)的dmem培养基(1％dmso)，37℃下孵育30分钟。移除dmem培养液，pbs7.2缓冲液洗涤2次，用荧光共聚焦显微镜进行荧光成像，发射波长为460nm。图11为a549细胞荧光成像图，图12为hek-293细胞荧光成像图。
实验证明，在整合素αvβ3相对高表达的a549细胞中，细胞膜被成功的标记，出现明显的荧光，而细胞内部和细胞外溶液中基本没有荧光显示，说明了化合物(viii)良好的膜靶向。在整合素αvβ3低表达的hek-293细胞中，没有明显的荧光出现，进一步证明了化合物(viii)的靶向功能。
技术特征：
1.一种整合素αvβ3靶向的aie荧光化合物，其结构如式(viii)所示：
2.制备权利要求1所述的荧光化合物的方法，所述方法包括：
(1)化合物(ii)与联硼酸频那醇脂在dmf溶剂中，70～80℃和氮气保护条件下，以pdcl2(dppf)为催化剂，在koac存在下进行suzuki反应，反应结束后分离纯化得到化合物(iii)；
(2)化合物(iii)与三苯基溴乙烯在thf和h2o混合溶剂中，70～80℃和氮气保护条件下，以pd(pph3)4为催化剂，在k2co3存在下进行suzuki反应，反应结束后分离纯化得到化合物(iv)；
(3)化合物(iv)脱去boc保护基得到化合物(i)；
(4)式(i)所示的苯丙氨酸衍生物在diea存在下，dmf溶剂中用fmoc-osu保护氨基得到化合物(v)；
(5)化合物(v)采用ctc树脂固相合成式(vi)所示五肽链，氨基酸c端到n端延伸顺序为fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、化合物(v)、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-gly-oh；
(6)化合物(vi)用3％tfa的dcm溶液切离树脂后，在hobt、edc、diea存在下进行缩合环化，得到化合物(vii)；
(7)化合物(vii)脱去氨基酸所有保护基，得到所述荧光化合物(viii)；
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中，化合物(ii)、联硼酸频那醇脂、pdcl2(dppf)和koac的物质的量之比为1:1.5:0.06:2.8。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)中，化合物(iii)、三苯基溴乙烯、pd(pph3)4、k2co3的物质的量之为1:1.2:0.05:3；溶剂中thf:h2o体积比为10:1。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(4)中化合物(i)：fmoc-osu：diea物质的量之比为1:1.5:3。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(6)中化合物(vi)：hobt：edc：diea物质的量之比为1:2:2:3。
7.权利要求1所述荧光化合物在制备用于荧光共聚焦细胞成像的荧光探针中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述荧光探针靶向整合素高表达的癌细胞。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述癌细胞为a549细胞。
技术总结
本发明提供了一种式(VIII)所示的AIE荧光环肽c(RGDf‑TPEK)，及其制备方法与应用。在不破坏靶向结构和功能的前提下，实现了整合素αvβ3的AIE荧光探针的构建。相比现有的荧光分子和靶向肽连接的策略，本发明将AIE分子嵌合于整合素αvβ3靶向肽c(RGDfK)的结构中，可以在整合素αvβ3高表达的肿瘤细胞表面发生聚集，分子内旋转受限(RIR)产生AIE发光，具有发光强度高，背景低和灵敏度高的特性。
技术研发人员：朱勍;蒋建泽;刘江
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：.09.24
技术公布日：.02.18
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