本发明涉及医药合成技术领域，特别涉及一种胆酸类衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
肝损伤是临床上常见的病理状态，引起肝损伤的原因有肝炎病毒、酒精、药物滥用、游离脂肪酸代谢综合征、影响肝脏免疫介导的炎症过程和遗传疾病等。肝细胞凋亡是肝脏损伤的一个特征，同时，肝细胞通过细胞增殖具有强大的再生功能。例如，肝切除术后70％的肝脏在大约1周内再生至其原始质量。但是，当细胞损失超过一定阈值时，肝脏的再生不足以抵消肝细胞凋亡，功能性肝细胞被纤维化疤痕所取代，损害了肝功能，并最终导致慢性肝病。因此，设计并合成可抑制肝细胞凋亡的化合物具有重要的临床治疗价值。
胆汁酸(胆酸)是一类具有独特的理化和生物学特性的类固醇分子。一方面，某些胆汁酸可引起肝细胞凋亡，这是胆汁淤积性肝病的常见病理特征。例如，甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)是甘氨酸与鹅去氧胆酸(cdca)的结合形式，已被证明可通过促进死亡受体fas/cd95的配体非依赖性寡聚来诱导肝细胞凋亡。另一方面，某些胆酸及其衍生物也显示出抑制肝细胞凋亡和保护肝脏的作用。研究表明，熊去氧胆酸(udca)通过调节经典的线粒体途径发挥细胞保护作用，从而降低了几种细胞类型的凋亡阈值。udca还可以通过调节动物模型中的e2f-1/p53/bax途径来抑制细胞凋亡。牛磺酸熊去氧胆酸(tudca)是牛磺酸与udca结合的形式，它也可以通过激活多种途径来抑制大鼠肝细胞凋亡。此外，udca，tudca和奥贝胆酸(oca，鹅去氧胆酸的6-乙基衍生物)表现出原发性胆源性胆管炎的治疗作用。但是，目前能够起到抑制肝细胞凋亡作用的有机物种类仍然较少。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明目的在于提供一种胆酸类衍生物及其制备方法和应用。本发明要提供的胆酸类衍生物可以有效抑制由甘氨鹅去氧胆酸诱导的肝细胞损伤，部分衍生物抑制肝细胞凋亡的活性优于阳性对照牛磺熊去氧胆酸，有望开发成新的肝脏保护类药物。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种胆酸类衍生物，具有式i所示结构：
式i中：r1为下列基团中的任意一种：
r2为下列基团中的任意一种：
r3为下列基团中的任意一种：
r1’为下列基团中的任意一种：
r2’为下列基团中的任意一种：
r3’为下列基团中的任意一种：
y为下列基团中的任意一种：
本发明提供了上述方案所述胆酸类衍生物的制备方法，包括以下步骤：
当r1与r1’相同，r2与r2’相同，r3与r3’相同，y为以下基团时，
所述胆酸类衍生物的制备方法包括以下步骤：
(1)在缩合剂作用下，将式a所示结构的化合物和n-羟基琥珀酰亚胺进行反应，得到具有式1-1所示结构的中间体；
(2)将具有式1-1所示结构的中间体、化合物y1和溶剂混合进行反应，得到胆酸类衍生物；所述化合物y1具有以下结构中的一种：
当r1与r1’相同，r2与r2’相同，r3与r3’相同，y为以下基团时：
所述胆酸类衍生物的制备方法包括以下步骤：
(i)在催化剂作用下，将式a所示结构的化合物和3,4-二氢-2h-吡喃、进行反应，得到具有式2-1所示结构的中间体；
(ii)在hobt、edci和dbu作用下，将具有式2-1所示结构的中间体和化合物y2进行缩合反应，得到具有式2-2所示结构的中间体；
所述化合物y2具有以下结构中的一种：
(iii)将所述具有式2-2所示结构的中间体和对甲苯磺酸吡啶鎓盐在溶剂中进行反应，得到胆酸类衍生物；
当r1与r1’不相同和/或r2与r2’不相同和/或r3与r3’不相同时，所述胆酸类衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)在缚酸剂作用下，将式a所示结构的化合物或式b所示结构的化合物和三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯进行反应，分别得到具有式3-1所示结构的中间体和具有式4-1所示结构的中间体；
(b)在hobt、edci和dbu作用下，将具有式3-1所示结构的中间体和具有式c所示结构的化合物进行缩合反应，得到具有式3-2所示结构的中间体；
(c)在氢气环境以及pd/c催化剂作用下，将具有式3-2所示结构的中间体在乙醇中进行氢化反应，得到具有式3-3所示结构的中间体；
(d)在hobt、edci和dbu作用下，将具有式4-1所示结构的中间体和具有式3-3所示结构的中间体进行反应，得到具有式3-4所示结构的中间体；
(e)将具有式3-4所示结构的中间体和氟化氢吡啶在溶剂中进行反应，得到胆酸类衍生物。
优选的，所述步骤(1)中的缩合剂包括n-(3-二甲基酰胺基丙基)-n"-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺和二异丙基碳二亚胺中的一种或几种。
优选的，所述步骤(1)中反应的温度为0～60℃，时间为1～24h；所述步骤(2)中反应的温度为0～60℃，时间为1～10h。
优选的，所述步骤(i)中的催化剂包括对甲苯磺酸一水合物、2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌和双(三甲基硅基)硫酸酯、高氯酸和四氯硅烷中的一种或几种。
优选的，所述步骤(i)中反应的温度为室温，时间为1～12h；所述步骤(ii)中反应的温度为0～60℃，时间为2～24h；所述步骤(iii)中反应的温度为0～100℃，时间为2～24h。
优选的，所述步骤(a)和步骤(d)中的缚酸剂独立地的包括n,n-二异丙基乙胺、2,6-二甲基吡啶、吡啶和三乙胺中的一种或几种。
优选的，所述步骤(a)中反应的温度为0～60℃，时间为1～24h；所述步骤(b)中反应的温度为0～60℃，时间为1～24h；所述步骤(c)中反应的压力为30～60psi，时间为8～48h；所述步骤(d)中反应的温度为0～60℃，时间为1～24h；所述步骤(e)中反应的温度为0～80℃，时间为1～24h。
本发明提供了上述方案所述胆酸类衍生物在制备肝脏保护类药物中的应用。
本发明提供了一种胆酸类衍生物，具有式i所示结构。本发明提供的胆酸类衍生物具有显著抑制肝细胞凋亡作用，可以有效抑制由甘氨鹅去氧胆酸诱导的肝细胞损伤，部分衍生物抑制率优于阳性对照牛磺熊去氧胆酸，为肝脏保护类药物的研发提供了参考，在制备肝脏保护类药物发明有广阔的应用前景。实施例结果表明，本发明提供的胆酸类衍生物抑制肝细胞凋亡的抑制率能够达到105.24％，而阳性对照牛磺熊去氧胆酸的抑制率为41.03％。
具体实施方式
本发明提供了一种胆酸类衍生物，具有式i所示结构：
式i中：r1为下列基团中的任意一种：
r2为下列基团中的任意一种：
r3为下列基团中的任意一种：
r1’为下列基团中的任意一种：
r2’为下列基团中的任意一种：
r3’为下列基团中的任意一种：
y为下列基团中的任意一种：
本发明提供了上述方案所述胆酸类衍生物的制备方法，包括以下步骤：
当r1与r1’相同，r2与r2’相同，r3与r3’相同，y为以下基团时，
所述胆酸类衍生物的制备方法包括以下步骤：
(1)在缩合剂作用下，将式a所示结构的化合物和n-羟基琥珀酰亚胺进行反应，得到具有式1-1所示结构的中间体；
(2)将具有式1-1所示结构的中间体、化合物y1和溶剂混合进行反应，得到胆酸类衍生物；所述化合物y1具有以下结构中的一种：
具体的合成路线如式一所示：
本发明在缩合剂作用下，将式a所示结构的化合物和n-羟基琥珀酰亚胺进行反应，得到具有式1-1所示结构的中间体；在本发明中，所述步骤(1)中的缩合剂优选包括n-(3-二甲基酰胺基丙基)-n"-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺和二异丙基碳二亚胺中的一种或几种；所述步骤(1)中反应用溶剂优选为超干dmf(n,n-二甲基甲酰胺)、超干dmso(二甲基亚砜)、超干dcm(二氯甲烷)和超干thf(四氢呋喃)中的一种或几种；所述步骤(1)中反应的温度优选为0～60℃，更优选为25～45℃，时间优选为1～24h，更优选为8～12h；所述反应优选为氩气保护条件下进行；在本发明中，所述式a所示结构的化合物、缩合剂和n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比优选为1:1.5:1.5。
步骤(1)反应完成后，本发明优选将产物料液和水混合后用乙酸乙酯进行萃取，所得有机相依次进行饱和碳酸钠洗涤、无水硫酸钠干燥和减压浓缩，得到白色粉末状产物，即为具有式1-1所示结构的中间体。
得到具有式1-1所示结构的中间体后，本发明将具有式1-1所示结构的中间体、化合物y1和溶剂混合进行反应，得到胆酸类衍生物。在本发明中，所述步骤(2)中反应的溶剂种类和步骤(1)中一致，在此不再赘述；所述步骤(2)中反应的温度优选为0～60℃，更优选为25～45℃，时间优选为1～10h，更优选为2～4h；所述反应优选在氩气保护条件下进行；本发明优选先将具有式1-1所示结构的中间体和溶剂混合，然后再滴加化合物y1，所述反应的时间从化合物y1滴加完毕开始计算；在本发明中，所述式1-1所示结构的中间体和化合物y1的摩尔比优选为2:1。
步骤(2)反应完成后，本发明优选将产物料液和水混合，然后用乙酸乙酯萃取，将所得有机相用无水硫酸钠干燥后进行减压浓缩，然后将浓缩产物进行硅胶柱色谱纯化，得到胆酸类衍生物。
当r1与r1’相同，r2与r2’相同，r3与r3’相同，y为以下基团时：
所述胆酸类衍生物的制备方法包括以下步骤：
(i)在催化剂作用下，将式a所示结构的化合物和3,4-二氢-2h-吡喃、进行反应，得到具有式2-1所示结构的中间体；
(ii)在hobt、edci和dbu作用下，将具有式2-1所示结构的中间体和化合物y2进行缩合反应，得到具有式2-2所示结构的中间体；
所述化合物y2具有以下结构中的一种：
(iii)将所述具有式2-2所示结构的中间体和对甲苯磺酸吡啶鎓盐在溶剂中进行反应，得到胆酸类衍生物；
具体的反应路线如式二所示：
本发明在催化剂作用下，将式a所示结构的化合物和3,4-二氢-2h-吡喃、进行反应，得到具有式2-1所示结构的中间体。在本发明中，所述催化剂优选包括对甲苯磺酸一水合物、2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌和双(三甲基硅基)硫酸酯、高氯酸和四氯硅烷中的一种或几种；所述步骤(i)中反应用溶剂优选为二氯甲烷、dmf、dmso、thf和1,2-二氯乙烷中的一种或几种；所述步骤(i)中反应的温度优选为室温，时间优选为1～12h，更优选为1～3h；本发明通过步骤(i)保护式a所示结构化合物中的羟基。
在本发明中，当式a所示结构化合物中r1、r2或r3为氢或乙基时，所述具有式2-1所示结构的中间体、具有式2-2所示结构的中间体的结构式中r1、r2和r3也为氢或乙基；当式a所示结构化合物中r1、r2或r3为羟基时，该羟基也会和3,4-二氢-2h-吡喃发生反应，即此时具有式2-1所示结构的中间体、具有式2-2所示结构的中间体的结构式中r1、r2或r3为
步骤(i)反应完成后，本发明优选将产物料液和水混合，然后用乙酸乙酯萃取，将所得有机相用无水硫酸钠干燥后进行减压浓缩，然后将浓缩产物进行硅胶柱色谱纯化，得到具有式2-1所示结构的中间体。
得到具有式2-1所示结构的中间体后，本发明在hobt(1-羟基苯并三唑)、edci(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和dbu(1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯)作用下，将具有式2-1所示结构的中间体和化合物y2进行缩合反应，得到具有式2-2所示结构的中间体。在本发明中，所述步骤(ii)中反应用溶剂优选为无水dmf；所述步骤(ii)中反应的温度优选为0～60℃，更优选为25～45℃，时间优选为2～24h，更优选为8～12h；所述反应优选为氩气保护条件下进行；本发明优选先将具有式2-1所示结构的中间体、hobt、edci、dbu和溶剂在0～60℃条件下搅拌混合0.5～1h，然后再加入化合物y2进行反应；在本发明中，所述具有式2-1所示结构的中间体、化合物y2、hobt、edci和dbu的摩尔比优选为1:0.5:1.2:2:2。
步骤(ii)反应完成后，本发明优选将产物料液和水混合，然后用乙酸乙酯萃取，将所得有机相用无水硫酸钠干燥后进行减压浓缩，浓缩得到的粗产物可直接进行下一步反应，无需进行纯化。
得到具有式2-2所示结构的中间体后，本发明将所述具有式2-2所示结构的中间体和对甲苯磺酸吡啶鎓盐(ppts)在溶剂中进行反应，得到胆酸类衍生物。在本发明中，所述步骤(iii)中反应用溶剂优选为甲醇、dcm、thf、dmso和二氯乙烷中的一种或几种；所述步骤(iii)中反应的温度优选为0～100℃，更优选为50～80℃，时间优选为2～24h，更优选为8～12h；在本发明中，所述有式2-2所示结构的中间体和对甲苯磺酸吡啶鎓盐的摩尔比优选为1:1；本发明通过步骤(iii)中的反应脱去具有式2-2所示结构的中间体中的羟基保护基，得到胆酸类衍生物。
步骤(iii)反应完成后，本发明优选将产物料液进行减压蒸馏除去溶剂，剩余物进行硅胶柱色谱纯化，得到胆酸类衍生物。
当r1与r1’不相同和/或r2与r2’不相同和/或r3与r3’不相同时，所述胆酸类衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)在缚酸剂作用下，将式a所示结构的化合物或式b所示结构的化合物和三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯进行反应，分别得到具有式3-1所示结构的中间体和具有式4-1所示结构的中间体；
(b)在hobt、edci和dbu作用下，将具有式3-1所示结构的中间体和具有式c所示结构的化合物进行缩合反应，得到具有式3-2所示结构的中间体；
(c)在氢气环境以及pd/c催化剂作用下，将具有式3-2所示结构的中间体在乙醇中进行氢化反应，得到具有式3-3所示结构的中间体；
(d)在hobt、edci和dbu作用下，将具有式4-1所示结构的中间体和具有式3-3所示结构的中间体进行反应，得到具有式3-4所示结构的中间体；
(e)将具有式3-4所示结构的中间体和氟化氢吡啶在溶剂中进行反应，得到胆酸类衍生物。
具体的反应路线如式三所示：
本发明在缚酸剂作用下，将式a所示结构的化合物和三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯进行反应，得到具有式3-1所示结构的中间体。在本发明中，所述缚酸剂优选包括包括n,n-二异丙基乙胺、2,6-二甲基吡啶、吡啶和三乙胺中的一种或几种；所述步骤(a)中反应用溶剂优选为无水dcm、无水dmf和无水thf中的一种或几种；所述步骤(a)中反应的温度优选为0～60℃，更优选为0～35℃，时间优选为1～24h，更优选为2～4h；所述反应优选在氩气保护条件下进行；本发明优选先将式a所示结构的化合物、缚酸剂和溶剂混合，然后在冰浴条件下滴加三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯，滴加完毕后撤去冰浴，在上述反应温度条件下进行反应。
在本发明中，当式a所示结构化合物中r1、r2或r3为氢或乙基时，所述具有式3-1所示结构的中间体、具有式3-2所示结构的中间体、具有式3-4所示结构的中间体的结构式中r1、r2和r3也为氢或乙基；当式a所示结构化合物中r1、r2或r3为羟基时，该羟基也会和三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯发生反应，即此时具有式3-1所示结构的中间体、具有式3-2所示结构的中间体、具有式3-4所示结构的中间体的结构式中r1、r2或r3为
本发明在缚酸剂作用下，将式b所示结构的化合物和三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯进行反应，得到具有式4-1所示结构的中间体。在本发明中，式b所示结构的化合物和三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯进行反应的条件、原料摩尔比以及后处理方法和式a所示结构的化合物和三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯进行反应时一致，在此不再赘述。
在本发明中，式b所示结构化合物中的羟基都需要进行保护，具体情况和式a所示结构化合物一致，在此不再赘述。
步骤(a)反应完成后，本发明优选将所得产物料液和水混合，然后用乙酸乙酯萃取，将所得有机相用无水硫酸钠干燥后进行减压浓缩，然后将浓缩产物进行硅胶柱色谱纯化，得到具有式3-1所示结构的中间体。
得到具有式3-1所示结构的中间体后，本发明在hobt、edci和dbu作用下，将具有式3-1所示结构的中间体和具有式c所示结构的化合物进行缩合反应，得到具有式3-2所示结构的中间体。在本发明中，所述步骤(b)中反应用溶剂优选为超干dmf、超干thf、超干dcm和超干dmso中的一种或几种；所述步骤(b)中反应的温度优选为0～60℃，更优选为0～35℃，时间优选为1～24h，更优选为8～12h；所述反应优选在氩气保护条件下进行；在本发明中，所述具有式3-1所示结构的中间体、具有式c所示结构的中间体、hobt、edci和dbu的摩尔比优选为1:1.5:1.5:2.5:2.5。
步骤(b)中反应完成后，本发明优选将产物料液和水混合，然后用乙酸乙酯萃取，将所得有机相用无水硫酸钠干燥后进行减压浓缩，然后将浓缩产物进行硅胶柱色谱纯化，得到具有式3-2所示结构的中间体。
得到具有式3-2所示结构的中间体后，本发明在氢气环境以及pd/c催化剂作用下，将具有式3-2所示结构的中间体在乙醇中进行氢化反应，得到具有式3-3所示结构的中间体。在本发明中，所述步骤(c)中反应的压力优选为30～60psi，更优选为40～60psi，时间优选为8～48h，更优选为8～24h；所述反应的温度优选为室温；所述反应优选在中压反应瓶中进行；本发明通过步骤(c)将具有式3-2所示结构的中间体进行氢化。
步骤(c)反应完成后，本发明优选将所得产物料液用硅藻土过滤，然后减压蒸除溶剂，剩余物进行硅胶柱色谱纯化，得到具有式3-3所示结构的中间体。
得到具有式4-1所示结构的中间体和具有式3-3所示结构的中间体后，本发明在hobt、edci和dbu作用下，将具有式4-1所示结构的中间体和具有式3-3所示结构的中间体进行反应，得到具有式3-4所示结构的中间体。在本发明中，所述步骤(d)中反应用溶剂优选为超干dmf、超干thf、超干dcm和超干dmso中的一种或几种；所述步骤(d)中反应的温度优选为0～60℃，更优选为20～35℃，时间优选为1～24h，更优选为8～12h；所述反应优选在氩气保护条件下进行；在本发明中，所述具有式4-1所示结构的中间体、具有式3-3所示结构的中间体、hobt、edci和dbu的摩尔比优选为1:1.2:1.5:2.5:2.5；本发明优选先将具有式4-1所示结构的中间体、hobt、edci、dbu和溶剂在0～60℃条件下搅拌混合0.5～1h，然后再加入具有式3-3所示结构的中间体进行反应。
步骤(d)反应完成后，本发明优选将产物料液和水混合，然后用乙酸乙酯萃取，将所得有机相用无水硫酸钠干燥后进行减压浓缩，然后将浓缩产物进行硅胶柱色谱纯化，得到具有式3-4所示结构的中间体。
得到具有式3-4所示结构的中间体后，本发明将具有式3-4所示结构的中间体和氟化氢吡啶在溶剂中进行反应，得到胆酸类衍生物。在本发明中，所述步骤(e)中反应用溶剂优选为四氢呋喃、dmf和dcm中的一种或几种；所述步骤(e)中反应的温度优选为0～80℃，更优选为20～35℃，时间为优选1～24h，更优选为2～3h；在本发明中，所述氟化氢吡啶和具有式3-4所示结构的中间体的用量比优选为1.7ml:1mmol；本发明优选先将具有式3-4所示结构的中间体溶解在溶剂中，然后再滴加氟化氢吡啶进行反应，所述反应的时间自氟化氢吡啶滴加完毕开始计算；本发明通过步骤(e)脱去具有式3-4所示结构的中间体中的羟基保护基。
步骤(e)反应完成后，本发明优选将所得产物料液和饱和碳酸氢钠溶液混合，然后使用乙酸乙酯萃取，将所得有机相用无水硫酸钠干燥后进行减压浓缩，然后将浓缩产物进行硅胶柱色谱纯化，得到胆酸类衍生物。
本发明还提供了上述方案所述胆酸类衍生物在制备肝脏保护类药物中的应用。本发明对所述应用的具体方法没有特殊要求，按照本领域技术人员熟知的方法进行应用即可。
下面结合实施例对本发明提供的方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(4r,4"r)-n,n"-(乙烷-1,2-二基)双(4-((3r,5s,7s,8r,9s,10s,13r,14s,17r)-3,7-二羟基-10,13-二甲基十六氢-1h-环戊[a]菲蒽-17-基)戊酰胺)的合成；记为化合物1a，步骤如下：
向烧瓶中依次加入熊去氧胆酸(10g，25.47mmol)，edci(4.40g，38mmol)，n-羟基琥珀酰亚胺(3.5g，30.5mmol)和无水dmf(50ml)，在35℃，氩气保护下搅拌反应12h。将水(120ml)加入反应中，并用乙酸乙酯(3×50ml)萃取。合并的有机相用饱和nahco3溶液(3×50ml)洗涤，并用na2so4干燥。减压浓缩萃取物，得到白色粉末状产物(1-1)(8.08g，64％)。1hnmr(600mhz,cd3od-d4)δ3.55-3.46(m,2h),2.84(s,4h),2.72-2.64(m,1h),2.62-2.52(m,1h),2.07(dt,j＝12.8,3.4hz,1h),1.98-1.79(m,4h),1.68-1.18(m,16h),1.13(q,j＝9.5hz,1h),1.09-1.04(m,1h),1.03-0.98(m,6h),0.76–0.73(m,3h).
将(1-1)(1.0g，2.04mmol)，乙二胺(0.061g，1.02mmol)和无水dmf(10ml)的溶液在35℃下搅拌10h。将水(40ml)加入反应中，并用乙酸乙酯(3×30ml)萃取。合并的萃取物用无水na2so4干燥，并在减压下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化。使用1:40至1:15的甲醇-二氯甲烷进行洗脱，得到终产物，为白色粉末(0.5195克，61％)；mp；149-153℃；
1hnmr(600mhz,cd3od-d4)δ3.53-3.44(m,4h),3.27(s,4h),2.28-2.20(m,2h),2.12-2.00(m,4h),1.95–1.87(m,4h),1.86-1.75(m,6h),1.66-1.00(m,38h),0.99-0.95(m,12h),0.72(s,6h).13cnmr(151mhz,cd3od-d4)δ177.19,72.04(d,j＝26.2hz),57.55,56.56,44.82,44.51,44.05,41.61,40.73,40.09,38.63,38.03,36.94,36.10,35.19,34.24,33.35,31.06,29.73,27.99,23.95,22.40,19.06,12.69.hrms-esi(m/z):calcd.forc50h84n2o6(m+h)+:809.6408,(m+na)+:831.6227；found:831.6274.
实施例2
乙烷-1,2-二基(4r,4"r)-双(4-(((3r,5s,7s,8r,9s,10s,13r,14s,17r)-3,7-二羟基-10,13-十六烷基二甲基-1h-环戊[a]菲基-17-基)戊酸酯)的合成，记为化合物2a；步骤如下：
向烧瓶中依次加入熊去氧胆酸(3g,7.64mmol),1,4-二恶烷(15ml)，3,4-二氢-2h-吡喃(1.93g,22.9mmol)及对甲苯磺酸水合物(0.29g,1.53mmol)，室温下搅拌3h。将水(50ml)加入反应中，并用乙酸乙酯(3×30ml)萃取。合并的萃取物用无水na2so4干燥，在减压下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化。用1:10至1:5乙酸乙酯-正己烷洗脱，得到(2-1)(2.8g,65％)，为白色粉末。1hnmr(600mhz,chloroform-d)δ3.94–3.82(m,3h),3.64–3.32(m,3h),2.43–2.34(m,1h),2.29–2.20(m,1h),2.01–0.96(m,22h),0.95–0.91(m,6h),0.69–0.63(m,3h).
将(2-1)(0.5g，0.9mmol)，hobt(0.15g,1.08mmol),edci(0.35g,1.8mmol),dbu(0.27g,1.8mmol)，无水dmf依次投入到反应瓶中，30℃下搅拌0.5h，向上述体系中加入乙二醇(0.028g,0.45mmol)，氩气保护下在35℃下再搅拌12h。将水(40ml)加入反应中，并用乙酸乙酯(3×30ml)萃取。合并的萃取物用无水na2so4干燥，减压浓缩，得到黄色油状的粗产物(2-2)(0.577g)，不经进一步纯化直接进行下一步。
将(2-2)(0.577g，0.503mmol)，甲醇(10ml)和对甲苯磺酸吡啶鎓盐(ppts，0.135g，0.503mmol)依次投入到反应瓶中，65℃下搅拌12h。减压除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱法纯化。用1∶100甲醇-二氯甲烷的洗脱剂进行洗脱，得到白色粉末状的终产物(0.240g,61％,自2-1起)。mp：99-102℃；1hnmr(600mhz,chloroform-d)δ4.27(s,4h),3.77–3.38(m,5h),2.42–2.33(m,2h),2.30–2.20(m,2h),2.06–1.95(m,3h),1.95–0.98(m,60h),0.94(d,j＝9.3hz,13h),0.68(s,6h).13cnmr(151mhz,chloroform-d)δ174.11,71.58,71.47,62.18,55.95,55.07,43.92,43.89,42.59,40.31,39.38,37.46,37.05,35.48,35.08,34.22,31.37,31.12,30.52,28.76,27.08,23.54,21.33,18.55,12.30.
hrms-esi(m/z):calcd.forc50h82o8(m+h)+:811.6089,(m+na)+:833.5908；found:833.5912.
实施例3
2-(2-(((r)-4-((3r,5s,7r,8r,9s,10s,13r,14s,17r)-3,7-二羟基-10,13-二甲基十六氢-1h-环戊[a]菲蒽-17-基)戊酰基)氧基)乙氧基)乙基(r)-4-((3r,5s,7s,8r,9s,10s,13r,14s,17r)-3,7-二羟基-10,13-二甲基十六氢-1h-环戊[a]菲蒽-17-基)戊酸酯的合成，记为化合物4a步骤如下：
将熊去氧胆酸(6.0g，15.28mmol)，diea(9.86g，76.40mmol)和无水dmf(60ml)的溶液在0℃下搅拌0.5h，然后将三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯(14.14g，53.49mmol)通过注射器逐滴添加至上述体系中，室温下在氩气保护下搅拌2h。将水加入上述反应液中，用乙酸乙酯(3×30ml)萃取，用无水na2so4干燥并减压浓缩，残余物通过硅胶柱色谱纯化。用1:30至1:20乙酸乙酯-正己烷洗脱，得到(3-1)，为白色粉末(5.98g；63％)；1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ3.74–3.60(m,1h),3.59–3.44(m,1h),2.46–2.33(m,1h),2.32–2.17(m,1h),2.00–1.90(m,1h),1.88–0.94(m,22h),0.94–0.80(m,24h),0.64(s,3h),0.13–0.01(m,12h).
将(3-1)(3.2g，5.16mmol),hobt(1.045,7.74mmol),edci(2.473g,12.9mmol),dbu(1.96g,12.9mmol)，无水dmf依次投入到反应瓶中，30℃下搅拌0.5h，向上述体系中加入2-[2-(苄氧基)乙氧基]乙醇(1.519g,7.74mmol)，并在氩气保护下在35℃下搅拌12h。将水(40ml)加入反应中，并用乙酸乙酯(3×30ml)萃取。合并的萃取物用无水na2so4干燥，减压浓缩，通过硅胶柱色谱纯化。用1:30至1:15乙酸乙酯-正己烷洗脱，得到(3-2)，为白色粉末(2.64g,64％)；1hnmr(500mhz,chloroform-d)δ7.37–7.27(m,5h),4.58(s,2h),4.23(t,j＝4.8hz,2h),3.76–3.59(m,8h),3.58–3.43(m,1h),2.45–2.31(m,1h),2.29–2.15(m,1h),2.05–0.94(m,32h),0.94–0.90(m,6h),0.90–0.82(m,24h),0.63(s,3h),0.08–0.02(m,12h).
向中压反应瓶中加入(3-2)(1.715g,2.15mmol)，pd/c(0.43g,w/w0.1:1)和乙醇(15ml)。混合物的空气用n2(g)置换3次，然后再用h2(g)置换3次。在室温下于45psi的压力下氢化12h。用n2(g)置换3次h2(g)，通过硅藻土过滤反应混合物，并在减压下除去溶剂。硅胶柱色谱纯化(乙酸乙酯/正己烷，1:15至1:5,v:v)，得到白色粉末状产物(3-3)：(1.17g,77％)。1hnmr(500mhz,chloroform-d)δ4.33–4.18(m,2h),3.81–3.44(m,8h),2.45–2.31(m,1h),2.31–2.16(m,2h),2.06–1.88(m,1h),1.85–0.94(m,28h),0.93–0.86(m,23h),0.64(s,3h),0.10–0.01(m,11h).
将鹅脱氧胆酸(5.0g，12.74mmol)，diea(8.22g，63.68mmol)和无水dmf(60ml)的溶液在0℃下搅拌0.5h，然后三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯(11.78g,44.58mmol)通过注射器逐滴添加至上述体系中，室温下在氩气保护下搅拌2h。将水加入反应中，并用乙酸乙酯(3×30ml)萃取。合并物用无水na2so4干燥并减压浓缩，通过硅胶柱色谱纯化。用1:30至1:20乙酸乙酯-正己烷洗脱，得到(4-1)，为白色粉末(4.83g,63％)；
将(4-1)(0.10g,0.161mmol),hobt(0.027g,0.201mmol),edci(0.0642g,0.335mmol),dbu(0.051g,0.335mmol)，无水dmf依次投入到反应瓶中，30℃下搅拌0.5h，向上述体系中加入(3-3)(0.095g,0.134mmol)，并在氩气保护下在35℃下搅拌12h。将水(40ml)加入反应中，并用乙酸乙酯(3×30ml)萃取。合并的萃取物用无水na2so4干燥，减压浓缩，通过硅胶柱色谱纯化(乙酸乙酯/正己烷1:20)得到产物(3-4)(0.16g,93％)。1hnmr(500mhz,chloroform-d)δ4.22(t,j＝4.7hz,4h),3.84–3.32(m,8h),2.45–2.30(m,2h),2.30–2.18(m,4h),2.07–0.92(m,67h),0.92–0.79(m,46h),0.63(d,j＝9.5hz,6h),0.12–0.01(m,25h).
在室温下，在塑料反应瓶中加入(3-4)(0.16g,0.123mmol)和四氢呋喃(thf,4ml)，然后在搅拌下滴加氢化氟吡啶(0.21ml)，室温下搅拌反应2h。将反应混合物滴加到饱和nahco3溶液中，并用乙酸乙酯(3×30ml)萃取。合并的萃取物用无水na2so4干燥，减压浓缩，通过硅胶柱色谱纯化。用1:15的乙酸乙酯-正己烷洗脱，得到终产物，为白色油状物(0.070g,61％)；。1hnmr(600mhz,chloroform-d)δ4.26–4.19(m,4h),3.87–3.82(m,1h),3.69(t,j＝4.8hz,4h),3.63–3.54(m,2h),3.50–3.42(m,1h),2.43–2.34(m,2h),2.30–2.16(m,3h),2.03–0.96(m,29h),0.95–0.90(m,12h),0.67(d,j＝10.7hz,6h).13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ174.25,174.22,72.03,71.45,71.37,69.15,68.51,65.60,63.34,55.81,55.75,54.90,50.48,43.77,42.71,42.46,41.50,40.16,39.88,39.67,39.44,39.21,37.31,36.89,35.38,35.35,35.29,35.07,34.96,34.63,34.10,32.86,31.15,31.14,30.96,30.94,30.67,30.59,30.34,28.66,28.20,26.92,23.74,23.42,22.80,21.20,20.60,19.21,18.42,18.32,13.76,12.17,11.81.
hrms-esi(m/z):calcd.forc52h86o9(m+h)+:855.6351,(m+na)+:877.6170,(m-h)+:853.6193；found:853.6152.
实施例4～19
其他条件和实施例1相同，仅将乙二胺(即化合物y1)进行替换，化合物y1根据表1中y基团的结构进行选择，所得产物记为化合物1b～1f。
其他条件和实施例2相同，仅将乙二醇(即化合物y2)进行替换，化合物y2根据表1中y基团的结构进行选择，所得产物记为化合物2b～2g。
其他条件和实施例2相同，仅将起始原料替换为鹅去氧胆酸；并将乙二醇(即化合物y2)进行替换，化合物y2根据表1中y基团的结构进行选择，所得产物记为化合物3a～3e。
实施例20
对实施例1～19制备的胆酸衍生物抑制肝细胞凋亡的活性进行测定，采用gcdca(甘氨鹅去氧胆酸)诱导原代小鼠肝细胞凋亡，将使用gcdca诱导的肝细胞与目标化合物共处理。通过测定半胱天冬酶3/7(caspase3/7)的水平来定量体外抑制肝细胞凋亡的活性，udca(熊去氧胆酸)，cdca(鹅去氧胆酸)，tudca(牛磺酸熊去氧胆酸)和oca(奥贝胆酸)作为阳性对照化合物。
(1)肝细胞分离与培养
将体重为20-30g(年龄：10周)的雄性balb/c小鼠维持在12h的昼夜节律下，自由摄取标准饮食和水直至实验当天。
通过胶原酶灌注技术分离肝细胞。将新鲜分离的肝细胞以1×106细胞/ml的密度悬浮在williame培养基的混合物中。培养的培养基是williame培养基，其中添加了10％fbs，100单位/毫升青霉素g钠和100毫克/毫升硫酸链霉素。将肝细胞保持在37.0℃,5％co2和潮湿气氛的培养箱中。细胞接种后4h更换培养基，以尽量减少死细胞的污染。将分离的肝细胞在不同的williame培养基中进行孵育，时长为4h，williame培养基分为加入gcdca(200μm)组/不加任何化合物组(用作空白对照)/加入目标化合物(分别为1a-4a)(20μm)和gcdca(200μm)的混合物组；
(2)caspase3/7活性
根据制造商的说明，使用caspase3/7分析试剂盒(promage，g8091)测量caspase3/7活性。
抑制率＝1-(化合物caspase-空白组caspase)/(gcdca组caspase-空白组caspase),结果列于表1。
化合物1a-4a的通式为：
表1化合物1a-5b的结构，物理数据和抗肝细胞凋亡活性
表1中：a表示其结构不适用于式i的结构通式，b表示熔点未经校正，c表示化合物为油；
根据表1中的结果可以看出，本发明提供的胆酸类衍生物具有显著的抑制肝细胞凋亡的活性，其中部分衍生物的肝细胞凋亡抑制率甚至高于阳性对照，化合物4a抑制肝细胞凋亡的抑制率能够达到105.24％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
技术特征：
1.一种胆酸类衍生物，其特征在于，具有式i所示结构：
式i中：r1为下列基团中的任意一种：
r2为下列基团中的任意一种：
r3为下列基团中的任意一种：
r1’为下列基团中的任意一种：
r2’为下列基团中的任意一种：
r3’为下列基团中的任意一种：
y为下列基团中的任意一种：
2.权利要求1所述胆酸类衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
当r1与r1’相同，r2与r2’相同，r3与r3’相同，y为以下基团时，
所述胆酸类衍生物的制备方法包括以下步骤：
(1)在缩合剂作用下，将式a所示结构的化合物和n-羟基琥珀酰亚胺进行反应，得到具有式1-1所示结构的中间体；
(2)将具有式1-1所示结构的中间体、化合物y1和溶剂混合进行反应，得到胆酸类衍生物；所述化合物y1具有以下结构中的一种：
当r1与r1’相同，r2与r2’相同，r3与r3’相同，y为以下基团时：
所述胆酸类衍生物的制备方法包括以下步骤：
(i)在催化剂作用下，将式a所示结构的化合物和3，4-二氢-2h-吡喃、进行反应，得到具有式2-1所示结构的中间体；
(ii)在hobt、edci和dbu作用下，将具有式2-1所示结构的中间体和化合物y2进行缩合反应，得到具有式2-2所示结构的中间体；
所述化合物y2具有以下结构中的一种：
(iii)将所述具有式2-2所示结构的中间体和对甲苯磺酸吡啶鎓盐在溶剂中进行反应，得到胆酸类衍生物；
当r1与r1’不相同和/或r2与r2’不相同和/或r3与r3’不相同时，所述胆酸类衍生物的制备方法包括以下步骤：
(a)在缚酸剂作用下，将式a所示结构的化合物或式b所示结构的化合物和三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯进行反应，分别得到具有式3-1所示结构的中间体和具有式4-1所示结构的中间体；
(b)在hobt、edci和dbu作用下，将具有式3-1所示结构的中间体和具有式c所示结构的化合物进行缩合反应，得到具有式3-2所示结构的中间体；
(c)在氢气环境以及pd/c催化剂作用下，将具有式3-2所示结构的中间体在乙醇中进行氢化反应，得到具有式3-3所示结构的中间体；
(d)在hobt、edci和dbu作用下，将具有式4-1所示结构的中间体和具有式3-3所示结构的中间体进行反应，得到具有式3-4所示结构的中间体；
(e)将具有式3-4所示结构的中间体和氟化氢吡啶在溶剂中进行反应，得到胆酸类衍生物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的缩合剂包括n-(3-二甲基酰胺基丙基)-n′-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺和二异丙基碳二亚胺中的一种或几种。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中反应的温度为0～60℃，时间为1～24h；所述步骤(2)中反应的温度为0～60℃，时间为1～10h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(i)中的催化剂包括对甲苯磺酸一水合物、2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌和双(三甲基硅基)硫酸酯、高氯酸和四氯硅烷中的一种或几种。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(i)中反应的温度为室温，时间为1～12h；所述步骤(ii)中反应的温度为0～60℃，时间为2～24h；所述步骤(iii)中反应的温度为0～100℃，时间为2～24h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)和步骤(d)中的缚酸剂独立地的包括n，n-二异丙基乙胺、2，6-二甲基吡啶、吡啶和三乙胺中的一种或几种。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中反应的温度为0～60℃，时间为1～24h；所述步骤(b)中反应的温度为0～60℃，时间为1～24h；所述步骤(c)中反应的压力为30～60psi，时间为8～48h；所述步骤(d)中反应的温度为0～60℃，时间为1～24h；所述步骤(e)中反应的温度为0～80℃，时间为1～24h。
9.权利要求1所述胆酸类衍生物在制备肝脏保护类药物中的应用。
技术总结
本发明涉及医药合成技术领域，提供了一种胆酸类衍生物及其制备方法和应用。本发明提供的胆酸类衍生物具有显著抑制肝细胞凋亡作用，可以有效抑制由甘氨鹅去氧胆酸诱导的肝细胞损伤，部分衍生物抑制率优于阳性对照牛磺熊去氧胆酸；本发明提供的胆酸类衍生物为肝脏保护类药物的研发提供了参考，在制备肝脏保护类药物方面有广阔的应用前景。
技术研发人员：王玉成;王菊仙;何红伟;牛伟萍;牛伟晓;张国宁;朱梅;王明华
受保护的技术使用者：中国医学科学院医药生物技术研究所
技术研发日：.11.25
技术公布日：.02.18
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