摘要：该研究旨在探讨肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞增殖的影响及抗癌生物活性肽(ACBP)对增殖的干预作用和可能的作用机制。收集5例手术切除患者的食管癌组织, 分离培养得到ESCC CAFs并进行特征指标鉴定; 建立CAFs与ESC细胞共培养体系, CFSE染色和流式细胞术检测细胞增殖; 收集CAF-1的条件培养基, 加入ACBP进行联合培养KYSE140细胞, IncuCyte检测细胞增殖; qRT-PCR和Western blot检测Hedgehog信号通路相关基因的表达水平。该研究成功分离CAFs, Western blot结果显示CAFs均表达波形蛋白(Vimentin)及纤维连接蛋白(Fibronectin), 不表达E-钙黏蛋白(E-cadherin); 相比于单独培养, 与CAF-1共培养的KYSE140细胞的CFSE水平降低, 细胞融合率增加(P<0.05), 细胞中的GLI1和PTCH1的mRNA和蛋白水平升高(P<0.05); 相比于条件培养基组, ACBP加入可以使KYSE140细胞的融合率下降(P<0.05); 相较于单独培养, ACBP加入后KYSE140细胞的GLI1和PTCH1的mRNA和蛋白水平显著下降(P<0.05)。该研究表明, CAFs可以通过激活Hedgehog信号通路促进食管癌细胞增殖, ACBP可在与CAFs共培养条件下通过抑制Hedgehog信号通路抑制食管癌细胞的生长。
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤, 目前占全球恶性肿瘤死亡率第6位[1]。食管癌在组织学上主要分为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell cancer, ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)。食管癌目前的治疗措施以外科手术为主, 结合化疗及放射治疗。尽管靶向治疗和免疫治疗等新的治疗方法已取得长足进步, 但食管癌患者的5年生存率依旧徘徊在20%左右[2], 亟待寻找新的更有效的治疗方法改善治疗效果。肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME是癌细胞启动、进展和迁移的利基, 是肿瘤发生、免疫逃逸的关键[3-5]。其中肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)是TME的关键成分, 支持癌细胞的增殖和迁移, 同时也保护癌细胞免受抗癌药物的毒性, 其参与包括食管癌在内的癌症的发生、血管生成、增殖、侵袭、转移和复发等生理过程[6-11]。
1980年在果蝇中发现的Hedgehog信号通路, 其是维持组织极性和干细胞数量的关键。Hedgehog信号通路的异常激活存在于各种类型的癌症中[12]。我们前期研究表明, 在癌前病变和食管癌中Hedgehog信号通路的表达被激活[13-14]。抗癌生物活性肽(anticancer biological active peptide, ACBP)是本实验室拥有自主知识产权的一种多肽, 前期研究显示, ACBP在体外和体内对胃癌和结直肠癌等肿瘤细胞具有显著的抑制作用[15-16]。本研究在建立ESCC细胞与原代培养CAFs共培养体系的基础上, 研究ACBP在CAFs存在的条件下是否影响食管癌细胞的增殖以及是否对Hedgehog信号通路产生影响。
1 材料与方法
1.1 细胞与主要试剂
人食管鳞状细胞癌细胞系KYSE140由内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心实验室保存。PBS、DMEM/F12培养基、胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)购自Gibco公司; Maxima Probe qPCR Master Mix购自Thermo Scientific公司
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