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本期，我们聚焦DNA羟甲基化。DNA羟甲基化是近年发现的一种新的DNA修饰并迅速成为研究热点。随着研究的深入，发现之前被认为是检测DNA甲基化“金标准”的重亚硫酸盐测序并不能区分DNA甲基化（5mC）和DNA羟甲基化（5hmC）。易基因联合剑桥大学建立了化学氧化法结合重亚硫酸盐转化的测序技术（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），该技术不仅可以精确检测DNA甲基化，排除DNA羟甲基化的影响，还可以双文库结合同时单碱基分辨率精确检测DNA羟甲基化。该方法非常适合用于需要对DNA甲基化和羟甲基化进行区分的研究测序分析。
oxBS-Seq技术原理
近日，西南民族大学Jincheng Zhong团队与西藏农牧科学院畜牧兽医研究所Jinwei Xin团队利用oxRRBS+RRBS技术揭示了牦牛下丘脑在神经调节和髓鞘形成中的表观遗传调控机制。该研究成果于9月27日发表在《FRONT GENET》（IF:4.599）杂志上。
1.背景：
5-甲基胞嘧啶 (5mC) 和 5-羟甲基胞嘧啶 (5hmC) 都是神经发育中重要的表观遗传修饰。然而很少有研究在自然高海拔条件下鉴定动物大脑区域的全基因组5mC和5hmC模式。
2.材料和方法：
从Riwoqe耗牛和三江牛（牛）中各选取三只54个月大的母牛，所选取的母牛在过去三代中没有直接或间接的血缘关系，在当地私人农场以同样的饮食喂养，耗牛和牛的平均活重为188.3公斤和163.0公斤。在饿一天后进行人道处死，解剖后迅速分离大脑、脑干、小脑和下丘脑，从中各收集1 cm3样本在液氮中快速冷冻并在-80°C下储存直至RNA和DNA提取。
利用RRBS+oxRRBS技术鉴定牦牛和牛的大脑、脑干、小脑、下丘脑的基因组5mC和5hmC位点，绘制全基因组DNA甲基化和羟甲基化图谱，并进行DNA甲基化/羟甲基化差异化分析和对应转录组的关联分析。
3.结果：
① RRBS+oxRRBS绘制牦牛和牛的大脑、脑干、小脑和下丘脑DNA甲基化和羟甲基化图谱
RRBS+oxRRBS测序单碱基水平检测牦牛和牛的大脑、脑干、小脑和下丘脑DNA甲基化和羟甲基化水平，平均CpG位点为3.28M，平均深度大于10X。
FIGURE 1：Global DNA methylation and hydroxymethylation among the samples.
（A） RRBS和oxRRBS文库中正链和负链修饰位点差异的Violin图
（B） Fisher精确检验计算RRBS和oxRRBS文库中羟甲基化水平和p值的Volcano图
（C） 牦牛编码基因中的甲基化和羟甲基化分布
（D） 牛编码基因中的甲基化和羟甲基化分布
② 牦牛和牛的下丘脑和其他大脑区域5mC和5hmC差异化分析
作者在牦牛和牛大脑区域的每次成对比较中确定差异甲基化区域（DMRs）和差异羟甲基化区域（DhMRs）。在耗牛和牛的下丘脑中发现大部分的DMRs和DhMRs，差异主要在于5mC水平下降和5hmC水平升高。作者进一步发现大多数DhMRs（牦牛72.9%，牛75.7%）与DMR相对应，表明5mC和5hmC水平在同一位点“升降”。耗牛样本的大脑、脑干、小脑和下丘脑组织RRBS文库的基因DNA修饰水平没有明显差异，而在牛样本这些组织中发现显著差异。因此，作者推测5mC和5hmC水平的“升降”可能是特定组织或生物过程中的一种调节机制，并证实了在未来研究中同时研究5mC和5hmC水平的必要性。
FIGURE 2：Identification of DMRs and DhMRs in yak and cattle.
（A）牦牛（上）和牛（下）两种组织样本中DMR（蓝）和DhMRs（黄）的数量比较。
（B）牦牛和牛样本各组织RRBS文库中总甲基化和羟甲基化分布。
（C）对牦牛DMRs平均甲基化水平的无监督聚类分析显示DMRs与神经系统相关的GO terms的基因富集相关联。
（D）对牦牛DhMRs平均羟甲基化水平的无监督聚类分析显示DhMRs与神经系统相关的GO terms基因富集相关联。
（E）对牦牛DhMRs相关基因mRNA水平的无监督聚类分析，显示与神经系统相关的GO terms基因富集相关联。
③ 转录组关联分析发现牦牛和牛的下丘脑具有特异性基因表达模式
作者对相应的转录组进行关联分析，转录组测序共获得22477个转录本，这些转录本被注释到GO、KEGG、TrEMBL数据库。与其他大脑组织相比，大多数差异表达基因(Differentially Expressed Gene,DEG)在下丘脑中发现，其中64.9%的DEGs在下丘脑中下调。这一结果进一步表明，5mC和5hmC水平的“升降”主要发生在CDS和内含子区域，可能对基因表达起调控作用。
FIGURE 3：Identification of DEGs in yak and cattle.
（A）牦牛（蓝色）和牛（黄色）各样本组织DEGs数量比较，“NA”表示未比较。
（B）牦牛下丘脑和大脑之间DEGs的GO terms和KEGG通路富集。
（C）牛下丘脑和脑干之间DEGs的GO terms和KEGG通路富集。
④ 牦牛下丘脑中5mC或5hmC调控的差异表达基因在神经调节和髓鞘形成中发挥作用
作者鉴定出652个可能受DMR或DhMR调控的基因，在这些基因中，上调基因的平均甲基化水平低于下丘脑下调基因，上调和下调的基因组在大脑、脑干和小脑中均显示出相似的基因表达水平。表明下丘脑中显示出不同的基因表达、DNA甲基化和羟甲基化谱。
在前五个上调基因中，PTGDS基因在下丘脑中高度转录，可能受启动子的hypoDMR调控。在前五个下调基因中，髓鞘碱性蛋白（MBP）在大脑、脑干和小脑中富集，且可能在下丘脑中受启动子和基因的hyperDMR调控。
FIGURE 4：DEGs associated with DMRs or DhMRs in yak.
（A）与其他脑组织相比，牦牛下丘脑与DMR/DhMR相关的DEGs平均甲基化和羟甲基化水平，将DEGs分成上调组和下调组。
（B）与其他脑组织相比，牦牛下丘脑中上调基因组的mRNA水平的无监督聚类。
（C）与其他脑组织相比，牦牛下丘脑中下调基因组的mRNA水平的无监督聚类。
（D）（左）耗牛最上调基因PTGDS侧翼3000bp的甲基化水平，（右）其中一个DMR区域的甲基化水平。
（E）（左）耗牛最下调基因MBP侧翼3000bp的甲基化水平，（右）其中一个DMR区域的甲基化水平。
在牛样本中，作者鉴定574个可能受DMR或DhMR调控的基因，只有16.03%在下丘脑和其他大脑区域存在差异表达。此外，与其他组织相比，牦牛下丘脑中前五个下调基因在牛下丘脑中也显示下调，而牦牛下丘脑中前五个上调基因中只有一个在牛下丘脑中显示上调。与髓鞘形成相关的下调基因MBP的mRNA水平可以通过牛下丘脑基因组高甲基化来调控。
FIGURE 5：DEGs associated with DMRs or DhMRs in cattle.
（A）牦牛和牛DMRs/DhMRs相关上调DEGs和下调DEGs的重叠。
（B）与其他大脑区域相比，牦牛和牛下丘脑中前五个上调基因和下调基因的mRNA水平热图。
（C）（左）牛的最下调基因MBP侧翼3000bp的甲基化水平，（右）其中一个DMR区域的甲基化水平。
易基因小结
本研究利用RRBS+oxRRBS技术发现牦牛和牛的下丘脑和其他大脑区域的5mC和5hmC存在显著差异，鉴定出差异甲基化区域（DMR）和差异羟甲基化区域（DhMR），其中大多数彼此重叠。最后，验证了DMRs和DhMRs调控的差异表达基因（DEGs）可能在神经调节和髓鞘形成中发挥重要作用。总之结果表明，5mC和5hmC介导的表观遗传调控可能广泛影响下丘脑的发育及其生物学功能，有助于提高高海拔条件的生理适应性。
本研究利用的RRBS+oxRRBS是易基因的成熟优势DNA修饰测序技术，该技术通过化学氧化结合重亚硫酸盐处理首先将5hmC氧化为5fC，进而可被重亚硫酸盐转换成U，从而排除了5hmC对5mC的信号干扰，达到精确检测基因组5mC的目的，具有实验数据优质、多组学分析数据精准等优势。
参考文献：/10.3389/fgene..592135
一文读懂：十大DNA甲基化研究核心问题
经验分享：DNA甲基化与多组学研究思路及科研论文写作
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