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《河南农业大学学报》第53卷第4期刊载了河南农业大学泡桐研究所的林丹,李冰冰,曹喜兵,赵振利,邓敏捷,范国强的论文——“植原体感染前后毛泡桐叶绿体全基因组测序分析”。该研究由国家重点研发计划项目(YFD060050604)资助。责任编辑蒋国良。
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叶绿体作为光合作用的中心，同时也在许多生化过程中起着重要的作用。叶绿体是具有DNA和蛋白质的合成系统的半自主性细胞器，属于母性遗传。叶绿体基因组结构及序列信息具有较高的保守性。泡桐属为玄参科乔木树种，是中国重要的速生经济用材。然而，由于泡桐丛枝病(PaWB)的广泛传播，染病后的泡桐会出现节间变短、叶片萎黄和丛枝等症状，影响了成年树木的生长速率，严重时更会导致幼树死亡，制约了泡桐农林产业的发展。目前，丛枝病的发病机制尚不清楚。
本研究首次利用高通量测序技术对毛泡桐的完整叶绿体cpDNA进行测序，并通过串联重复、散在重复和简单重复序列(SSR)和分析，有助于探究被子植物进化模式，为研究泡桐光合作用机制，培育抗病、抗害虫新品种奠定一定的遗传信息背景，并且有利于研究泡桐属的进化位置，为叶绿体分子生物学研究奠定了一定的基础。
以河南农业大学林木生物技术实验室培养的毛泡桐健康组培苗 (Pto)和病苗组培苗 (PtoI)为材料。利用TIANGEN植物基因组提取试剂盒对样品进行总DNA的提取，测序，采用Illumina HiSeq双末端测序策略进行建库测序。使用Illumina Hiseq 4000 进行双末端测序，测序reads长度为PE150 bp，最后得到原始数据量(raw data)，对测得的raw data 进行过滤得到有效数据(clean data) 用于后面组装。再利用SOAPdenovo v2.04 拼接软件对优化序列进行多个Kmer参数的拼接，依据拼接序列的总长、scaffold 的数量等技术指标进行综合评定，从而分别选择K-mer 最优结果作为最终的组装结果。
运用GapCloser v1.12软件对组装结果进行局部内洞填充和碱基校正，以得到最后的组装结果。利用DOGMA 软件对叶绿体基因组中包含的gene、rRNA 和tRNA 进行预测，然后在进行人工矫正。运用BLAST 算法将所获得的预测基因与NR、KEGG、COG和GO数据库进行比对以进行功能注释分析。cpDNA完成图由 OGDRAW v1.2软件绘制。对叶绿体基因组进行特征比较分析。使用NCBI中BLAST命令将毛泡桐的病健苗碱基序列进行比对，并利用软件Repeat Masker 3-3-0 和 TRF对重复序列进行预测。最后，利用MISA分析软件鉴定毛泡桐简单重复序列(SSR) 位点。
研究结果表明，毛泡桐病苗和健康苗的叶绿体基因组由反向重复区(IRs)、长单拷贝序列区(LSC)和短单拷贝序列区(SSC)等部分组成。其中，叶绿体基因组全长分别为154 700 bp (Pto)和154 646 bp (PtoI)，IRs的长度为257 79 bp，LSC和SSC长度分别为85 356 bp、17 786 bp (Pto) 和85 356 bp、17 732 bp (PtoI)，进一步证明了叶绿体DNA序列的保守性特点。生物信息学分析表明，在Pto中共搜索到简单重复位点(SSR) 64个，单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸的数量分别为49、5、2、7和1个；PtoI中共有64个SSR位点，单核苷酸个数为49个，并未发现六核苷酸。大多数位点都富含A-T，具有碱基偏好性。
本研究中发现泡桐丢失了ycf68、orf42和orf56等假基因或者开放阅读框。同时，研究发现毛泡桐中共鉴定18个基因包含内含子，而内含子可以作为提高植物转化率的有用工具。这为利用叶绿体基因组工程进行泡桐属植物的抗逆育种提供了重要的参考价值。毛泡桐叶绿体基因组中的重复序列主要位于LSC区域，表明了这些重复序列可能与叶绿体的光合作用相关。通过病健苗序列比对发现病苗中缺失一段54bp的重复序列，该缺失序列可能位于ndhD基因 (编码NADH脱氢酶亚基4) 启动子区域 (100~200 bp)，推测植原体侵染植物后，可能导致了ndh上游序列的缺失，进而影响了下游编码基因的表达，使得叶绿体光合作用减弱，从而影响植物的正常生长发育。PtoI叶绿体基因组的SSR可能由于植原体的感染与Pto相比而具有一定的差异性，通过对感染植原体前后毛泡桐叶绿体基因组SSR分析, 能进一步了解到毛泡桐患病前后其核苷酸序列发生的变化，对个体水平的遗传差异研究有进一步的的促进作用。
通信作者：
范国强，河南农业大学泡桐研究所所长，教授，博士生导师。主要从事森林培育、林木生物技术、泡桐方面的研究。多次到美国、澳大利亚、新西兰、英国访学。现为新世纪“百千万人才工程”国家级人选、国家有突出贡献中青年专家、国务院政府特殊津贴专家、全国优秀科技工作者、中原学者、河南省特聘教授、河南省优秀专家、河南省首批杰出专业技术人才、河南省跨世纪学术技术带头人、河南省科技创新团队带头人、河南省特色学科--林学学科带头人，河南省和国家林业局重点森林培育学科第一学术带头人、中国林业青年科技奖和河南优秀杰出青年基金获得者、河南省师德标兵、河南省文明教师、“感动中原”年度教育人物、十三届全国政协委员。以第一完成人获国家科技进步二等奖2项、省科技进步一等奖3项、二等奖5项，授权发明专利2项，获得国家新品种保护权5个，省审泡桐优良新品种8个，制定发布国家林业行业标准3个、省地方标准5个，发表论文162篇（SCI论文47篇），出版着作5部。
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