本发明涉及量子点技术领域，具体而言，涉及n,s掺杂碳量子点材料及其制备方法和应用。
背景技术：
自以来，荧光碳量子点作为一种新型的纳米材料引起了广泛的关注。由于碳量子点具有粒径小(10nm左右)，生产成本低，出色的光学性能，优异的水溶性和良好的生物相容性等优点，荧光碳量子点在光电、能量转换、光催化、生物成像、疾病诊断和药物递送的多个应用领域中成为了极具应用前景的纳米材料。碳量子点与金属和聚合物等其他荧光材料相比，碳量子点具有保持发光更稳定的特点，还可以替代有毒的重金属离子，从而降低医疗毒性，并克服其他有机染料光漂白等缺点。这些吸引人的优异光学性能和良好的生物安全性，使荧光碳量子点在近年来的生物医学领域引起了广泛的关注。
在碳量子点的许多特性中，荧光性质是碳量子点最基本和最重要的性质。然而，根据先前的报道，碳量子点在多个应用领域中仍然具有一些缺点。
鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供n,s掺杂碳量子点材料及其制备方法和应用。本发明提供的n,s掺杂碳量子点材料量子产率高，受激发后可以发散出绿色荧光，其水溶性好，在偏酸和偏碱环境，紫外照射下及不同强度离子溶液中荧光强度稳定，具有细胞毒性低，血液相容性和生物相容性好的特点。
本发明是这样实现的：
本发明的发明人发现，大多数碳量子点的发射光谱主要在蓝光区域，而不是在长波区域(例如绿光到红光)。同时，大多数碳量子点在用作荧光成像剂时还具有量子产率低的缺点。其次，大多数碳量子点缺少亲水基团，例如磺酸根，磷酸根或多羟基部分，会导致碳点在酸性和碱性溶液中的溶解性和光稳定性差。在体内应用时，还必须考虑碳量子点的生物安全性，因为它们可能与血细胞相互作用并影响血细胞正常功能，例如：由于碳量子点引起的溶血和红细胞堆积导致循环障碍甚至致命的细胞毒性，从而限制了碳量子点的许多临床应用(例如生物成像，疾病诊断和药物输送)。因此，迫切需要具有长波发射光谱，在酸性和碱性溶液中具有良好的溶解性和光稳定性以及在体内具有良好的生物相容性的碳量子点。
基于此，第一方面，本发明实施例提供一种n,s掺杂碳量子点材料的制备方法，其包括：将含有吐氏酸和间苯二胺溶解的前驱体溶液进行反应，以制得n,s掺杂碳量子点。
本发明实施例的制备方法以间苯二胺和吐氏酸作为碳来源，以期所含有的n元素和s元素作为掺杂元素的来源，通过自下而上的简单方法进行合成，制备出的n,s掺杂碳量子点量子产率高，例如高达37.2％，可发射绿色荧光，水溶性好；将该碳量子点分别置于到不同ph溶液中、不同离子强度的nacl溶液中和长时间紫外照射下荧光强度未发生明显变化，具有良好的荧光强度稳定性；此外，通过细胞毒性试验显示，该碳量子点具有良好的血相容性和生物相容性；该碳量子点可作为一种在生物成像、分子示踪、细胞标记、疾病诊断和药物输送等领域运用的纳米材料。
此外，本发明提供的制备方法工艺简单，制备周期短，制作成本低，所需原料简单易得，所述方法重复性好，有利于工业扩大。
在可选的实施方式中，所述前驱体溶液中吐氏酸与间苯二胺质量比为2-4:9-11。
在可选的实施方式中，前驱体溶液中吐氏酸与间苯二胺质量比为3:10。
通过控制吐氏酸与间苯二胺合适的质量比，可以使得荧光强度有显著增加，又使得原料成本最小化。
在可选的实施方式中，所述前驱体溶液中吐氏酸的浓度为2-4mg/ml；间苯二胺的浓度为9-11mg/ml。
在可选的实施方式中，所述前驱体溶液中吐氏酸的浓度为3mg/ml；间苯二胺的浓度为10mg/ml。
控制吐氏酸和间苯二胺在合适浓度范围下，有利于提高n,s掺杂碳量子点的得率和其荧光强度。在可选的实施方式中，所述反应的条件为：温度180-220℃，时间3h以上，优选为10h。
控制合适的反应条件，如180-220℃条件下反应3h以上，有助于提高产品得率，提高终产品量子点的荧光强度。
在可选的实施方式中，在反应釜中进行所述反应。
在可选的实施方式中，所述反应釜为不锈钢高压釜。
在可选的实施方式中，在衬里材质为聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中进行所述反应。
在可选的实施方式中，所述前驱体溶液由吐氏酸和间苯二胺分散于有机溶剂中得到。
在可选的实施方式中，有机溶剂为乙醇。
在可选的实施方式中，通过超声将吐氏酸和间苯二胺分散于所述有机溶剂中。
在可选的实施方式中，进行超声的频率为38-42khz，超声的时间为10min以上。
通过超声处理，可以使吐氏酸和间苯二胺能够更好地分散于醇溶剂中，有助于提高产品得率，提高终产品量子点的荧光强度。
在可选的实施方式中，所述制备方法还包括：在所述反应结束后，对得到的悬浊液进行固液分离，收获滤液。
在可选的实施方式中，采用中空膜分离过滤器进行固液分离。
在可选的实施方式中所述中空膜分离过滤器的分子截留量选自3kda、5kda、10kda和20kda中的至少一种。
在可选的实施方式中，所述制备方法还包括：往所述滤液中加入naoh进行沉淀。
在可选的实施方式中所述制备方法还包括：将经沉淀后的滤液进行离心，收获沉淀。
在可选的实施方式中，离心条件如下：10000-12000rpm、离心10min以上。
在可选的实施方式中，所述制备方法还包括：对所述沉淀进行干燥，得到所述n,s掺杂碳量子点材料。
在可选的实施方式中，在真空条件下进行干燥。
在可选的实施方式中，干燥的温度为58-62℃，干燥的时间为8h以上。
在可选的实施方式中，s掺杂碳量子点材料。
第二方面，本发明实施例提供一种n,s掺杂碳量子点材料，其由前述实施方式所述的制备方法制备得到。
该n,s掺杂碳量子点材料荧光产率高达37.2％，是一般碳量子点的20倍左右，并且在405nm激发下可发绿色荧光，比蓝色荧光的量子点具有更广泛的生物运用价值；另外，该n,s掺杂碳量子点材料粒径分布均匀，在较宽的ph范围内荧光强度稳定、无明显细胞毒性、并且血液相容性评价效果好同时生物相容性高，可以拓宽其在细胞标记、疾病诊断、药物输送等领域的体内相关应用。
第三方面，本发明实施例提供了上述n,s掺杂碳量子点材料在生物成像或分子示踪中的应用。
第四方面，本发明实施例提供一种用于生物成像的试剂或用于分子示踪的试剂，其含有前述实施方式所述的n,s掺杂碳量子点材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1的n,s掺杂碳量子点的透射电镜形貌图像；
图2为实施例1的n,s掺杂碳量子点的粒径分布图；
图3为实施例1的n,s掺杂碳量子点在水溶液中的量子产率图；
图4为实施例1的n,s掺杂碳量子点在不同激发波长下的荧光发射图谱；
图5为实施例1的n,s掺杂碳量子点的红外光谱图；
图6为实施例1的n,s掺杂碳量子点的x射线光电子能谱图；
图7为实施例1的n,s掺杂碳量子点在不同ph值下的荧光强度图；
图8为持续紫外照射下实施例1的n,s掺杂碳量子点的荧光强度图；
图9为不同离子强度下实施例1的n,s掺杂碳量子点的荧光强度图；
图10为实施例1的n,s掺杂碳量子点对huvec细胞的毒性评价图；
图11为huvec细胞对不同浓度的实施例1的n,s掺杂碳量子点摄取后的共聚焦成像图；
图12为huvec细胞在多种抑制剂下对实施例1的n,s掺杂碳量子点摄取后的共聚焦成像图；
图13为huvec细胞在多种抑制剂下对实施例1的n,s掺杂碳量子点摄取后的荧光强度统计图；
图14为不同浓度的实施例1的n,s掺杂碳量子点处理红细胞2h和4h后的溶血率图；
图15为红细胞用实施例1的n,s掺杂碳量子点处理后的扫描电镜图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的n,s掺杂碳量子点的制备方法如下：
(1)以间苯二胺和吐氏酸作为碳来源，以吐氏酸和间苯二胺所含有的n和s作为掺杂元素的来源，制备出前驱体，操作如下：
取吐氏酸和间苯二胺，与20ml100％乙醇混合，控制吐氏酸和间苯二胺的终浓度分别为3mg/ml和10mg/ml；二者在溶液中质量比为3:10；进行超声分散，超声频率40khz，超声时间为15min，使吐氏酸和间苯二胺均匀分散在乙醇溶液中，得到前驱体溶液。
(2)将步骤(1)所得的前驱体溶液加入聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，置于200℃下反应10h，结束后，冷却至室温，得到碳点悬浊液；
(3)采用20kda的中空纤维膜分离过滤器对步骤(2)所得的碳点悬浊液进行固液分离，获取滤液，备用。
(4)往步骤(3)所得滤液与12.5mol/lnaoh溶液按体积比1：2(滤液：naoh)混合并进行沉淀，10000rpm离心10min，获取沉淀，备用。
(5)将步骤(4)所得沉淀在真空条件下干燥，干燥的温度为60℃，干燥的时间为8h，得到n,s掺杂的高致发光的碳量子点。
实验例1
检测实施例1得到的n,s掺杂碳量子点的相关指标和性能
(1)图1是实施例1得到的n,s掺杂碳量子点的透射电镜图，可以看出，该n,s掺杂碳量子点呈规则的单分散球形，其平均粒径为2.59nm，晶格间距约为0.14nm，反映了该n,s掺杂碳量子点的晶面。
(2)图2是实施例1得到的n,s掺杂碳量子点的粒径分布结果统计，从图2可以看出该n,s掺杂碳量子点的粒径在1nm到5nm之间。
(3)取实施例1的n,s掺杂碳量子点配成饱和溶液，取20μl纯化的实施例1的n,s掺杂碳量子点稀释至2ml溶液，并测量400至650nm范围内的发射光谱，然后，在相同条件下测量2ml蒸馏水(空白样品)，通过比较样品和空白样品，利用爱丁堡fs5荧光光谱仪测出n,s掺杂碳量子点的绝对量子产率。
图3是实施例1得到的n,s掺杂碳量子点的绝对量子产率检测结果，可以看出绝对量子产率达37.2％，高量子产率可能是由于n,s掺杂碳量子点中包含的芳族结构可以形成较大的π共轭结构，并且n,s掺杂碳量子点表面上的氨基进一步增加了共轭程度，并增加了n,s掺杂碳量子点的基态电子跃迁到最低激发态的可能性。
(4)将20μl纯化的n,s掺杂碳量子点加入2ml各种ph的pbs中。然后，在3min后以380～650nm的波长范围和在440nm的激发波长下记录荧光光谱，将所有测量重复三次，然后取平均值。
图4是实施例1得到的n,s掺杂碳量子点的不同激发波长下的荧光发射图谱，可以看出，该n,s掺杂碳量子点稀释在乙醇中时，在440nm下有最强的荧光强度，其荧光发射波谱峰位置为520nm，其比蓝色荧光发射波长更长，属于绿色荧光的波长范围，更具有生物利用价值。
(5)图5是实施例1得到的n,s掺杂碳量子点的傅里叶变换红外(ftir)光谱测试结果，从图中进一步证实了该n,s掺杂碳量子点的表面具有-oh、c＝o、c-o、c＝c、c-n和-nh2的存在。
(6)图6是实施例1得到的n,s掺杂碳量子点的xps分峰图谱，从图中可以看出该n,s掺杂碳量子点表面含有大量的c、o、n和s。
(7)图7是实施例1得到的n,s掺杂碳量子点的稀释在不同ph的溶液中的荧光光谱图，从图中可以看出，该n,s掺杂碳量子点的光致发光特性在很宽的ph范围(3～9)几乎保持不变，其荧光强度稳定性较高，表明实施例1得到的n,s掺杂碳量子点独特的光致发光特性可以用于酸性和碱性环境。
(8)测试紫外线照射对n,s掺杂碳量子点的荧光强度的影响。
将20μln,s掺杂碳量子点稀释至2ml，并在紫外线下照射不同的时间，然后测量n,s掺杂碳量子点溶液的荧光强度。
图8是实施例1得到的n,s掺杂碳量子点在持续紫外(365nm)照射下的荧光光谱图，从图中可以看出，该n,s掺杂碳量子点的光致发光特性在持续紫外照射下几乎保持不变，表明不同的环境条件对n,s掺杂碳量子点的光学性质影响较小。
(9)将20μln,s掺杂碳量子点稀释至2ml不同浓度的na+溶液中，并充分混合使其平衡，然后测量溶液的荧光强度。
图9是实施例1得到的n,s掺杂碳量子点稀释在不同强度的离子溶液中的荧光光谱图，从图中可以看出，该n,s掺杂碳量子点的光致发光特性在不同强度的离子溶液中几乎保持不变，表明该n,s掺杂碳量子点独特的光致发光特性可以用于不同强度的离子溶液环境。
(10)将huvec细胞在含10％fbs和1％青霉素和链霉素的dmem中置于37℃，5％co2孵箱中培养24小时。将不同浓度的n,s掺杂碳量子点加入到共聚焦培养皿中，并与huvec细胞一起孵育6小时。然后，将细胞用pbs洗涤3次。用共聚焦激光(zeisslsm880)检测细胞荧光成像。结果见图10。
图10是不同浓度的实施例1得到的n,s掺杂碳量子点的细胞毒性评价结果，由图可知，在0-300μg/ml浓度的n,s掺杂碳量子点存在条件下，huvec的细胞活力没有明显变化，即使在最高浓度的n,s掺杂碳量子点存在下，细胞活力也比对照组保持90％以上，表明n,s掺杂碳量子点存在具有低细胞毒性。
(11)图11是实施例1得到的n,s掺杂碳量子点的细胞摄取共聚焦荧光成像的实验结果，根据图中结果可以看出，该n,s掺杂碳量子点可以被huvec细胞摄取，并且主要存在于细胞质中而不存在于细胞核中。此外，随着n,s掺杂碳量子点浓度的增加，细胞质中的荧光强度也同时增加，这与大多数纳米颗粒相似。(12)huvec分别用nan3(80μg/ml)，秋水仙碱(coclchicine，100μg/ml)，制霉菌素(nystain，25μg/ml)，氯丙嗪(chlorpromazine，10μg/ml)或阿米洛利(amiloride，50μg/ml)预处理1h，然后用300μg/mln,s掺杂碳量子点处理3小时。用共聚焦激光(zeisslsm880)在405nm激发波长下检测细胞荧光成像。通过流式细胞术(bdlsrfortessa)分析huvec细胞的荧光强度。结果见图12和图13。
图12是在不同抑制剂(氯丙嗪、叠氮化钠、制霉菌素、阿米洛利或秋水仙碱)存在下，实施例1的n,s掺杂碳量子点的细胞摄取的共聚焦成像结果，图13是图12的荧光强度统计结果，根据以往的研究，纳米粒子的表面化学性质，粒径，亲水性或疏水性均会影响其内在化途径，然而图12和图13的结果表明，这些抑制剂对实施例1的n,s掺杂碳量子点的细胞内在化没有明显影响，这可能是由于该n,s掺杂碳量子点通过能量无关的方式穿过细胞膜进而表现出优异的细胞穿透能力。(13)取小鼠的全血放入带有肝素钠的离心管中，并以2000rpm离心5min。除去上清液，然后用pbs溶液重悬直至上清液透明和透明。用pbs(ph＝7.4)将红细胞重悬至2％的红细胞原液分散液。然后，将2％红细胞原液在37℃下孵育2和4小时，分别与不同浓度的n,s掺杂碳量子点孵育4h，用pbs溶液和1％tritonx-100溶液作为阴性对照和阳性对照。最后，将上述溶液以2000rpm离心5分钟，然后将100μl上清液移至96孔板中，然后用酶标仪测量540nm处的上清液的吸光度。另外将小鼠的全血离心以除去上清液，然后将红细胞与n,s掺杂碳量子点孵育10min后，将pbs洗涤3次，在室温下用4％多聚甲醛(pfa)固定2h，然后在4℃下固定过夜，然后通过乙醇梯度(50％，60％，70％，80％，100％，v/v)脱水，干燥后，通过扫描电子显微镜(phenompro)完成观察到的培养基的形态。
图14是实施例1的n,s掺杂碳量子点处理红细胞2h和4h后的溶血率图，图15是实施例1的n,s掺杂碳量子点处理红细胞后的扫描电镜图，从图中可以看出，该n,s掺杂碳量子点未表现出对红细胞的溶血性并且红细胞的形态也未发生变化，表明实施例1的n,s掺杂碳量子点具有良好的血液相容性，可用于体内潜在的生物成像剂。
为了提高所得碳量子点的光学稳定性和生物安全性，拓宽碳量子点在细胞标记、疾病诊断、药物输送等领域的应用，在选择合适的碳源、简易制备的方法、提高光学稳定性和血液相容性方面仍有很大的探索空间。本发明实施例通过自下而上的方法进行合成，通过掺入氮和硫元素合成碳量子点，并提高了碳量子点的荧光量子产率。
目前碳量子点存在发射光谱短、量子产率低和光稳定性差等问题。为进一步改善碳量子点的发射波长、提高荧光量子产率及光稳定性、并提高其生物相容性，从而使其有效应用于细胞内和生物体内的荧光标记，本发明实施例制备出了一种超低浓度氮和硫元素掺杂的、水溶性好、稳定性高、发光强度强且生物相容性好的碳量子点。
本发明实施例提供的碳量子点可为生物医疗领域提供一种来源丰富、制备简单、成本可控、低毒高效、且生物相容性好的水溶性纳米荧光材料，在生物成像和药物示踪方面有很大的应用前景，未来更有望应用于纳米靶向诊断和靶向治疗等。故在疾病的早期诊断、预防和精准治疗方面将起到显著的促进作用，发挥良好的社会效益和经济效益。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种n,s掺杂碳量子点材料的制备方法，其特征在于，其包括：将含有吐氏酸和间苯二胺的前驱体溶液进行反应，以制得n,s掺杂碳量子点。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述前驱体溶液中吐氏酸与间苯二胺质量比为2-4:9-11；
优选地，所述前驱体溶液中吐氏酸与间苯二胺质量比为3:10。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述前驱体溶液中吐氏酸的浓度为2-4mg/ml；间苯二胺的浓度为9-11mg/ml；
优选地，所述前驱体溶液中吐氏酸的浓度为3mg/ml；间苯二胺的浓度为10mg/ml。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述反应的条件为：温度180-220℃，时间3h以上，优选为10h；
优选地，在反应釜中进行所述反应；
优选地，所述反应釜为不锈钢高压釜；
优选地，在衬里材质为聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中进行所述反应。
5.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述前驱体溶液由吐氏酸和间苯二胺分散于有机溶剂中得到；
优选地，有机溶剂为乙醇。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，通过超声将吐氏酸和间苯二胺分散于所述有机溶剂中；
优选地，超声的频率为38-42khz，超声的时间为10min以上。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：在所述反应结束后，对得到的悬浊液进行固液分离，收获滤液；
优选地，采用中空膜分离过滤器对所述悬浊液进行固液分离；
优选地，所述中空膜分离过滤器的分子截留量选自3、5、10和20kda中的至少一种；
优选地，所述制备方法还包括：往所述滤液中加入naoh进行沉淀；
优选地，所述制备方法还包括：将经沉淀后的滤液进行离心，收获沉淀；
优选地，离心条件如下：10000-12000rpm、离心10min以上；
优选地，所述制备方法还包括：对所述沉淀进行干燥，得到所述n,s掺杂碳量子点；
优选地，在真空条件下进行干燥；
优选地，干燥的温度为58-62℃，干燥的时间为8h以上。
8.一种n,s掺杂碳量子点材料，其特征在于，其由权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到。
9.如权利要求8所述的n,s掺杂碳量子点材料在生物成像或分子示踪中的应用。
10.一种用于生物成像的试剂或用于分子示踪的试剂，其特征在于，其含有权利要求8所述的n,s掺杂碳量子点材料。
技术总结
本发明公开了一种N,S掺杂碳量子点材料及其制备方法和应用，涉及量子点技术领域。本发明公开的制备方法将含有吐氏酸和间苯二胺的前驱体溶液进行反应，以制得N,S掺杂碳量子点。本发明公开的N,S掺杂碳量子点材料量子产率高，受激发后可以发绿色荧光，其水溶性好，在偏酸和偏碱环境，紫外照射下及不同强度离子溶液中荧光强度稳定，且具有细胞毒性低、血液相容性和生物相容性好等特点。
技术研发人员：蔡璐璐;童荣生;何林;钟建;陈新棉
受保护的技术使用者：四川省人民医院
技术研发日：.12.05
技术公布日：.02.14
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