继利用纳米孔测序进行新冠病毒全基因组测序实时监测疫情和病毒变异，在《柳叶刀》上发表两篇文章后，香港大学袁国勇院士研究团队近期在《临床微生物学》杂志发表了最新文章，使用纳米孔测序技术识别和鉴定可用于甲型流感病毒分子学检测的新型诊断靶点。
准确检测甲型流感病毒（IAV）是患者管理、感染控制和流行病学监测的重要一环。当前甲型流感病毒的RT-PCR诊断标准推荐使用M基因作为靶点。然而，由于最近甲流病毒中的新型基因突变，使用M基因的RT-PCR敏感性已有所下降。
使用纳米孔测序甲型流感病毒临床样本的全基因组，研究团队根据所获得的读长序列比对数量，选择了两个基因PB2和NS作为RT-PCR诊断目标，并显示新设计的NS和PB2引物和探针可标靶不同亚型的季节性和人畜共患病型甲型流感病毒。检测限（Limit of Detection）验证显示，PB2和NS基因RT-PCR方法与标准M基因RT-PCR相似甚至更低，此外还检测到了M基因RT-PCR所漏检的阳性样本。使用临床采集的鼻咽和唾液样本进行方法学验证，团队获得了对甲型H1N1、甲型H3N2和甲型H7N9流感病毒检测100%敏感性和特异性。
作者表明，PB2或NS基因可作为甲型流感病毒RT-PCR诊断中M基因的合适替代方法。纳米孔测序技术有助于鉴定新的诊断靶点。
DOI:10.1128/JCM.02127-19
使用纳米孔全基因组测序识别高丰度的病毒基因组区域
从和住院的成年患者（年龄区间为26-91岁）采集的样本中，研究团队使用了来自13名A(H1N1)患者、5名A(H3N2)患者的共18份鼻咽样本以及一份唾液样本。在提取RNA进行样本准备，添加条码标签（barcode）和测序接头（纳米孔SQK-LSK109试剂盒）进行混样文库制备后，使用便携式MinION测序仪测序运行6-12小时，之后使用Guppy软件的快速模式进行碱基识别。
纳米孔测序序列结果显示，在病毒的内部基因中，NS基因在所有患者样本中呈现高丰度；在编码聚合酶的基因中，大部分序列位于5’UTR和3‘UTR，其中多数样本中以PB2基因序列数目最高。因此，团队将NS基因和PB2基因选作RT-PCR的目标。
研究团队将设计的PB2和NS基因引物和探针与GISAID和NCBI GenBank数据库中的病毒序列进行比对后，显示与季节性甲型H1N1和甲型H3N2流感病毒，以及从人类分离出的甲型流感病毒亚型H5、H6、H7、H9和H10匹配良好，且与非流感病毒无同源性。
在季节性甲型流感病毒（H1N1和H3N2）以及两个常见可感染人类的禽流感病毒（H5N1和H7N9）中，PB2和NS基因RT-PCR显示出比标准推荐的M基因更低或相似的检测限。并在鼻咽和唾液样本中获得了对甲型H1N1、甲型H3N2和甲型H7N9流感病毒检测的100%敏感性和特异性。
研究团队接下来分别在包含阳性和阴性样本的共320份鼻咽和唾液临床样品中验证了两个新型基因诊断靶点，并成功检测到了M基因RT-PCR所遗漏的阳性样本。作者在总结中表示，PB2或NS基因可作为甲型流感病毒RT-PCR诊断中M基因的合适替代方法。不同基因靶点的结合有助于增强在人类和动物中监测甲型流感病毒的准确性。
《柳叶刀》文章：
1. A familial cluster of pneumonia associated with the novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster.
DOI:/10.1016/S0140-6736(20)30154-9
2. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study
DOI:/10.1016/S1473-3099(20)30196-1
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