利用纳米孔测序技术实时测定病毒全基因组信息（Nanopore Real-time Sequencing），能够动态地分析病毒分子进化来研究病毒的变异及传播特征，这些信息对疫情发展不同阶段制定有效的防控政策非常重要。近日，连续两篇利用纳米孔测序技术对SARS-CoV-2基因组学流行病学研究的文章发表于【Cell】期刊。
文章一：揭示中国广东省SARS-CoV-2基因流行病学传播规律
由广东省公共卫生研究院、广东省疾病预防控制中心、牛津大学以及ARTIC Network国际团队合作，使用纳米孔掌上测序仪MinION，建立了实时的纳米孔新冠病毒快速测序分析方法，对病毒含量较低（CT值 >30）的病例标本仍能保持较高的基因组覆盖度，且不同稀释倍数下测序结果显示拼接序列的准确性未受影响。
DOI : 10.1016/j.cell..04.023
通过宏基因组测序以及多重PCR结合纳米孔MinION测序完成了广东省53株SARS-CoV-2病毒的全基因组序列，通过序列分析结合流行病学信息，该研究揭示多数广东的COVID-19病例为不同区域的输入感染，并非来自本地连续大范围的传播。这对后续广东省有效开展的输入性传播的防控策略具有行动上的指导意义，对疫情发展不同阶段所需采取的干预措施，以及对其它地区开展新冠病毒测序分析并科学解释序列结果极具参考价值。
主要研究发现：
疫情发展的三个阶段
本研究描述了广东省新冠疫情发展的三个不同时期：早期主要为湖北地区的输入病例；中期呈现本地病例数量的增加并随后得到控制；3月后主要为国外输入病例数量的增加（图1A）。在不同时期，广东省采取了不同的监测策略（图1A），通过大范围监测结合密切追踪和严格隔离应对新冠疫情的暴发。
图1. 广东省新冠病毒暴发疫情 （A）1,388例COVID-19确诊病例及病例来源信息；（B）广东省COVID-19确诊病例主要分布在珠三角地区
新冠病毒基因组测序方法
团队通过宏基因组测序及实时纳米孔多重PCR扩增子测序法，对1月30日至2月28日的62例病例的79份标本的病毒序列进行了测定，利用本地构建的脚本及ARTIC实验方案的分析脚本共获得53份较为完整的病毒基因组（图2）。团队建立了纳米孔三代测序和分析方法，实现对病毒基因组的实时、快速测定。对比宏基因组方法，对病毒含量较低（CT值 >30）的病例标本，仍能保持较高的基因组覆盖度。
同时，研究团队还使用纳米孔多重PCR扩增子测序方法对新冠病毒分离毒株核酸进行梯度稀释测序，结果表明，随着稀释倍数的升高，获得的病毒基因组覆盖度有所下降，但是对拼接序列的准确性没有影响。
图2. 53株SARS-CoV-2病毒全基因组信息及其对应的病例信息。
表1 不同稀释倍数下病毒基因组的覆盖度与测序准确性评估
病毒的序列特征及传播特征
依据测定的新冠病毒序列，研究人员分析了新冠病毒在广东省的传播特点。序列信息表明，多数广东的病例序列（红色圆点表示）散发在整个进化树中，中间穿插着来源于其他地方或国家的序列（图3）。该结果表明，多数广东的COVID-19病例为不同区域的输入感染，并非来自本地连续大范围的传播。
研究团队同时发出警示，在SARS-CoV-2病毒传播的速度要远快于其序列突变速度的情况下，系统性和连续的疫区病例基因数据，加上相关的流行病学数据支持，可以有效避免对进化关系分析结果产生错误的因果关系判断。例如，团队发现5个主要由本地序列形成的簇（A-E），如果仅从进化关系上可能认为这些序列对应的病例为本地传播形成（图3&4），然而结合流行病学调查结果，可以发现cluster中的多数序列都具有湖北旅居暴露史。表明这些观察到的广东聚集序列可能是由多个同源或高度同源的输入病例序列形成。
图3. 基于广东省SARS-CoV-2序列及公共数据库序列构建的最大似然树（A）及基于贝叶斯框架的分子钟进化树（B）。广东省的SARS-CoV-2序列用红色圆点表示。
图4. 对5个广东序列簇进行分子溯源分析。
重要意义：
研究首次结合基因序列数据及流行病学数据揭示了广东省内新冠病毒基因组流行病学特征。尤其是在人口高密度并存在频繁外来疫情输入的珠三角区域，通过及时大范围的分子监测，积极的病例追踪，加上严格的隔离措施可有效阻断本地的传播链条。
随着当前广东省从其他国家输入性病例数量的增加，持续进行并加强新冠病毒疫情的监控十分必要。广东省疾控的研究团队表示，及时公开新冠病毒序列不仅可以更精确的分析病毒在不同区域的传播特点，同时对病毒序列中差异位点的解析也将对病毒疫苗的研究及抗病毒药物的开发提供重要信息。
该研究第一作者为广东省公共卫生研究院陆靖，刘哲以及牛津大学和爱丁堡大学的Louis du Plessis和Verity Hill。通讯作者为牛津大学的Oliver G Pybus和广东省疾病预防控制中心的柯昌文。研究受广东省新冠病毒科技计划项目、广东省协同创新平台和广东省重点研发项目的资助。合作单位包括广东省第二人民医院，广州市CDC，深圳市CDC，佛山市第一人民医院，英国ARTIC团队。源起健康的王建、董冰冰在实验过程中提供了支持和帮助。
文章二：揭示美国早期SARS-CoV-2跨州传播基因流行病学规律
自1月新型冠状病毒首次在美国西北部被发现，到3月美国所有的50个州均发生疫情大爆发。为阐明SARS-CoV-2在美国的传播来源和模式，耶鲁大学公共卫生学院微生物疾病流行病学的Joseph等合作团队，使用纳米孔掌上测序仪MinION，结合ARTIC Network工作流，14小时内完成了对美国康涅狄格州首批9名COVID-19患者的靶向病毒基因组测序，通过系统进化树分析表明，这些感染源可能来自华盛顿，是由州际之间传播，并非国际间传播。这对于地方政府对疫情的监测并缓解未来的疫情爆发至关重要，因为国内的旅行极大可能导致该输入性疫情的再次爆发。
DOI: 10.1016/j.cell..04.021
主要结论：
靶向SARS-CoV-2基因组测序
研究小组的取样时间为3月6-14日，样本来自于康涅狄格州八个不同城市的无国际旅行史的患者居民。利用Oxford Nanopore Technologies便携式测序仪MinION，使用扩增子测序的方法，研究小组在收到样本不到14小时即完成了SARS-CoV-2基因组测序，工作流程包括RNA提取、PCR检测与结果验证、文库制备、测序、实时碱基识别与读长序列定位。基因组信息已经上传至GISAID数据库（序列号：GISAID EPI_ISL_416416-416424）。
系统进化树分析
结合公共数据库种其他168个SARS-CoV-2基因组信息，研究小组使用最大似然重建方法建立了系统发育树，并使用共享的核苷酸替代（Nucleotide Substitutions）来评估其进化分支。结果显示前9个SARS-CoV-2基因组聚集成三个不同的分支，这表明多个独立的感染事件发生。基因组CT-Yale-001与来自亚洲的其他病毒序列聚成一簇，CT-Yale-006基因组则与来自欧洲和华盛顿州的病例数据密切相关。然而，CT-Yale-001和CT-Yale-006这两名患者都没有相关旅行史，这表明这些患者均来自未被发现的国内传播链的一部分。其他7个基因组则与美国患者的一个大分支聚成一簇，其中大部分来自华盛顿州，由于缺乏更多美国其他地区的数据，因此目前无法确定这些病毒的确切国内来源。重要的是，数据表明，3月初到中旬的时候，COVID-19已经存在跨州传播。
图1 9个病毒基因组系统进化树分析
基因组流行病学研究的重要意义
系统分析树表明康尼狄格州爆发的COVID-19一定程度上由美国国内传播引起。使用不同地区的航空旅行数据和旅游线路来评估国际间传播的风险发现，在对各个国家进行旅行限制之后，国内传播有可能会导致该州出现新的疫情爆发，这有助于帮助制定实时合理有效的新冠病毒监测和预防方案，具有极大的疫情防控意义。
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